[发明专利]一种利用离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法在审
申请号: | 201410847613.9 | 申请日: | 2014-12-29 |
公开(公告)号: | CN104450662A | 公开(公告)日: | 2015-03-25 |
发明(设计)人: | 方昱 | 申请(专利权)人: | 临沂市宏昱生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N11/02 | 分类号: | C12N11/02;C12N9/10;C12R1/69 |
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地址: | 276499 *** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 利用 离子交换 纤维 固定 果糖 转移酶 制备 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一种果糖基转移酶固定化方法,具体是一种利用离子交换纤维固定化果糖基转移酶的制备方法,果糖基转移酶高活性菌丝体发酵、酶法细胞分解提取酶液、离子交换纤维固定化果糖转移酶。
背景技术
离子交换纤维 (Ion Exchange Fiber,简称IEF) 是一种纤维状离子交换材料,离子交换纤维作为新型功能高分子材料,具有独特的化学及物理吸附和分离功能,在一些相关领域有着不可代替的作用。离子交换纤维具有以下特点:形状多样,可制成长短纤维,也可织布编网,易于制成各种组件,并可根据其应用目的而选择其最好的形状、交换容量大、比表面积大、交换速度快,一般能达到颗粒状树脂的20倍,并且具有吸附效率高、易于再生等优点、再生速度快,循环使用次数多,使用中纤维损耗低。在生物酶固定化领域是利用带胺基的离子交换纤维与酶的之间的静电引力来实现接枝方式进行固化,是新型的生物酶固定化载体材料。
果糖基转移酶(fructosyltransferase ,FTase ,EC2. 4. 1. 9) 能催化水溶液蔗糖分子内转移生成蔗果低聚糖。其酶促反应机理:当以蔗糖为底物时,最初只有蔗果三糖(GF2 ) 和葡萄糖(G) 生成:2GF →GF2+ G,但随着反应进行下去,蔗果三糖( GF2 ) 和蔗果四糖(GF3 ) 也可以作为反应底物,其反应分别是: 2GF2 →GF3 + G; 2GF3 →GF4 (蔗果五糖) + G,也可用一个反应方程式来描述FTase 的酶促反应: GFn + GFn →GFn + 1 + GFn– 1,是工业上酶法转化蔗糖制备低聚果糖(FOS)的关键酶。酶是否能回收再次使用是各研究机构及企业研究重点,其中,把果糖基转移酶固定于特定载体上是最有效的途径。如中国专利 CN01128345.9公开了阐述了一种以蔗糖为原料,工业化生产蔗果低聚糖(低聚果糖)方法,它包括固定化果糖基转移酶制剂的工业化生产以及利用该酶制剂进行工业化生产FOS两部分:一、选择具有能分泌果糖基转移酶的优良菌株,在合适的培养基中培养,然后将培养得到的大量菌丝体进行破壁,用离心法和超滤法将酶分离纯化,再用壳聚糖或树脂为载体以戊二醛为交联试剂将酶固定下来,固定化条件:PH=4~9,温度=10~60℃,搅拌转速=20~100r/min,酶活与载体比=20~160U,交联剂戊二醛浓度=0.05~0.3%。固定化果糖基转移酶可重复使用多次;二、分批反应法或柱式反应法以固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖;采用本发明方法得到的蔗果低聚糖产品不必经过活性碳脱色,不需离子交换柱脱盐,可以获得Brix≥75,固形物中总低聚糖≥50%的FOS糖浆;中国专利CN200910094419.7公开一种新型果糖基转移酶固定化方法,包括下列步骤:(1)向壳聚糖醋酸溶液中加入 0.01%~0.05%粘合剂聚乙烯吡咯烷酮;(2)将上述壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的NaOH 溶液中,制备壳聚糖球形颗粒,并将壳聚糖球形颗粒用蒸馏水洗涤至中性;(3)将中性壳聚 糖球形颗粒置于pH=7的磷酸缓冲液中,加入戊二醛交联剂,使之键合在壳聚糖球形颗粒上, 并充分洗涤,以除掉未键合的戊二醛;(4)将键合了戊二醛的壳聚糖球形颗粒置于pH=7磷 酸缓冲液,然后向其中加入果糖基转移酶,使之固定化;本发明固定了果糖基转移酶,提高了壳聚糖作为固定化酶载体的机械强度,提高了酶负载量;中国专利CN200910026901.7公开一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法,属于固定化果糖基转 移酶的技术领域。本发明包括游离果糖基转移酶的制备及果糖基转移酶的固定化两部分,本发明筛选出了大孔阴离子树脂D380、D296R、或D301-III为载体, 以戊二醛为交联剂,采用先吸附后交联的方法进行固定化。载体材料价格低廉,机械强度好,物化性能稳定,容易再生,树脂吸附酶间接起到提取作用,因此对于粗酶液的纯度没有过高的要求,有利于工业化生产,所得固定化酶酶活回收率可达81.2%以上,可循环使用10次。
以上几种固定化果糖基转移酶比游离酶有较好工业应用前景,实现了可回收重复使用特点,但是以上几种方法都存在制备较繁杂,固定化后活性不高、固定化酶半衰期短、使用较多化学试剂、使用具有毒性戊二醛作交联剂,由于反应过程中部酶脱落造成戊二醛游离出对产品有食品安全风险,固定化酶机械抗性差等不足。
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