[发明专利]CD63在制备肝脏疾病诊断试剂盒或制备预防或治疗肝脏疾病药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物工程技术领域，提供了肝干细胞的特异性表面分子标志物CD63及其应用，特别是CD63在制备肝脏疾病诊断试剂盒或制备预防或治疗肝脏疾病药物中的应用，并通过该表面标志物从肝脏中快速分离和培养扩增肝干细胞的方法。具体涉及应用肝干细胞的表面特异性标志物，通过流式分选的方法从肝脏细胞悬液中快速分离出肝干细胞，并实现肝干细胞在体外的扩增和双向分化，以及在肝脏疾病动物模型肝脏内的再植。

背景技术

组织干细胞是指存在于个体已经分化的组织中的未分化细胞，这种细胞具有自我更新和特化形成该组织的细胞的能力。组织干细胞存在于机体的各种组织器官中，是组织器官稳态维持的结构和功能基础。成年个体组织中的组织干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，只有在病理状态或在外界因素的作用下才能被激活增殖并向该组织的细胞类型分化。肝脏中的肝干细胞被认为存在于Hering’s管和胆管腺中，具有产生肝细胞和胆管上皮细胞的双向分化潜能。在正常肝组织中，肝干细胞的数量极少，只有当肝脏受损并且肝细胞的增殖受到抑制或是肝脏受到持续的大规模慢性损伤时，肝脏中的肝干细胞才能被激活，即所谓的“胆管反应”。在动物模型中常联合应用能够抑制肝细胞增殖的药物(如倒千里光碱、对乙酰氨基酚等)和三分之二肝切来诱导胆管反应，而在人类的慢性肝病中(如慢性病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等)常到观察到胆管反应的存在。

肝干细胞的分离培养及其深入研究对于肝脏发育，肝脏损伤后再生、肝脏肿瘤的发生的机理以及各种原因导致的终末期肝脏疾病的细胞治疗都具有十分重要的研究意义和应用价值。由于肝干细胞在肝脏中存在的数量极少，目前报道肝干细胞的分离的方法尚不完善。Li等通过千里光碱联合2/3肝切诱导胆管反应后，将肝脏制备成细胞悬液，经过分级离心去除肝实质细胞后，再通过差速贴壁的方法将肝干细胞纯化(Li WL,Su J,Yao YC,Tao XR,Yan YB,Yu HY,Wang XM,Li JX,Yang YJ,Lau JT,Hu YP,Isolation and characterization of bipotent liver progenitor cells from adult mouse,Stem Cells,24(2),322-332)，该种分离纯化肝干细胞的方法比较繁琐，且不易从正常肝组织中分离出肝干细胞。近年来，通过Foxl1，CD133和Lgr5等肝干细胞的表面标志物结合流式或磁珠分选的方法从正常肝脏或诱导胆管反应的肝脏中分离出肝干细胞(Shin S,Walton G,Aoki R,Brondell K,Schug J,Fox A,Smirnova O,Dorrell C,Erker L,Chu AS,Wells RG,Grompe M,Greenbaum LE,Kaestner KH,Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential,Genes Dev.25(11):1185-1192；Dorrell C,Erker L,Schug J,Kopp JL,Canaday PS,Fox AJ,Smirnova O,Duncan AW,Finegold MJ,Sander M,Kaestner KH,Grompe M,Prospective isolation of a bipotentialclonogenic liver progenitor cell in adult mice.Genes Dev.25(11):1193-1203；Huch M,Dorrell C,Boj SF,van Es JH,Li VS,van de Wetering M,Sato T,Hamer K,Sasaki N,Finegold MJ,Haft A,Vries RG,Grompe M,Clevers H,In vitro expansion of single Lgr5+liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration,Nature.494(7436):247-250.)，但这些标志物并不能有效区分肝干细胞和胆管细胞。因此，现有的分离肝干细胞的方法操作繁复或是分离的肝干细胞纯度较低，目前尚没有能够快速从肝脏组织中特异分离纯化肝干细胞的方法。