[发明专利]一种以烟草花叶病毒RNA解旋酶为靶标的抗病毒药物虚拟筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物筛选方法，尤其涉及以烟草花叶病毒RNA解旋酶为靶点，利用分子对接进行的新型抗烟草花叶病毒药物的虚拟筛选方法。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)是一种典型的烟草花叶病毒属(tobamovirus)病毒，能感染以烟草为代表的一系列茄科植物，病征包括萎缩、坏死、叶片卷曲以及叶片组织上深浅绿色混合的特征性的花斑图案等。

现有烟草花叶病的综合防治措施包括选择抗性品种、合理施肥、烟草生长发育过程中进行卫生管理以及化学防治等。其中，化学防治手段大体可以分为天然源抗病毒剂和化学合成抗病毒剂两大类，其作用机制主要可以分为以下三类：(1) 抑制病毒侵染宿主；(2) 抑制病毒增殖和扩散；(3) 诱导寄主产生抗病性。而在医药抗病毒药物方面，其药物分子设计与作用机制研究的焦点还包括了逆转录酶、聚合酶、蛋白酶、解旋酶等病毒复制所必须的功能蛋白。

TMV的RNA基因组含有四个开放读码框(open reading frame, ORF)，共编码四个蛋白，分别是126-kDa和183-kDa复制蛋白、30-kDa运动蛋白以及17.5-kDa的外壳蛋白。126-kDa的复制蛋白以一个琥珀终止密码子(amber codon)UAG结束，该终止密码子通读为酪氨酸时产生一个183-kDa的蛋白。126-kDa和183-kDa蛋白均含有甲基转移酶以及解旋酶结构域，183-kDa蛋白的通读部分则包含了一个典型的RNA依赖的RNA聚合酶基序。

实验证明，在缺乏解旋酶的情况下，病毒不能继续侵染或破坏宿主细胞。近十几年来，以解旋酶作为抗病毒药剂作用靶标已有一定的研究。常见的解旋酶抑制剂结构主要包括核苷类似物、聚苯、金属离子螯合剂、黄酮、多环芳香族聚合物、香豆素等，根据其作用机制又可以分为三类：(1)抑制解旋酶催化的ATP水解；(2)抑制解旋酶催化的核酸分离；(3)扰乱解旋酶与寄主因子之间的相互作用。而截至目前，尚无以TMV解旋酶作为药物作用靶标的药物分子设计或药物作用机制研究。

发明内容

本发明的目的是建立一种以TMV的RNA解旋酶为靶点的抗TMV药物的虚拟筛选方法，以丰富现有的筛选方法。

本发明的另一个目的是提供一种确定TMV的RNA解旋酶与ATP结合时活性构象的三维结构的方法。

本发明利用先进的计算机技术，结合活体抗TMV治疗活性测试方法，旨在发现能有效结合TMV的RNA解旋酶的活性位点以抑制其ATP依赖的解旋酶活性的药物，从而阻断TMV的复制进而达到防治烟草花叶病毒引起的多种植物病毒病。

本发明提供一种以烟草花叶病毒RNA解旋酶为靶标的抗病毒药物的虚拟筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 通过分子模拟软件确定解旋酶结合ATP时的活性构象的三维结构数据；

(2) 采用分子对接软件，依据活性位点的氨基酸残基，确定分子对接的活性中心，设定活性口袋；

(3) 对小分子配体进行筛选，建立对接用小分子配体数据库；

(4) 根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子配体与活性口袋一一进行对接；

(5) 根据对接结果的排序，进行综合评价，初步确定具有抗烟草花叶病毒效果的候选化合物。

上述的虚拟筛选方法中，步骤(1)所述结合ATP的解旋酶的三维结构通过以下步骤确定：

(1) 通过氨基酸序列比对得到已知三维结构的模板蛋白，采用分子模拟方法，同源模建烟草花叶病毒RNA解旋酶三维结构；

(2) 对同源模建的烟草花叶病毒RNA解旋酶结构进行分子动力学优化；

(3) 通过三维结构比对，得到三维结构类似的解旋酶与ATP复合物三维结构，通过活性位点氨基酸残基叠合的方式，得到烟草花叶病毒RNA解旋酶与ATP结合的初始结构；

(4) 通过分子动力学优化，得到解旋酶结合ATP时的活性构象的三维结构数据。

上述虚拟筛选方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子对接活性位点，可以是解旋酶结合RNA或ATP的活性位点。

上述虚拟筛选方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子对接活性位点，可以是解旋酶的变构中心。

上述虚拟筛选方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子对接活性位点，可以是影响解旋酶活性的其他氨基酸残基。

上述虚拟筛选方法，所述的小分子配体数据库，可以是已有的免费或商用数据库；