[发明专利]一种精液冷冻保存液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物体液保存技术领域，具体的说涉及一种精液冷冻保存液及其制备方法。

背景技术

由于家畜繁殖生产中生物安全性也开始逐渐受到人们的关注，许多研究者对精液冷冻添加卵黄、牛奶等动物源成份提出异议，认为可能带来微生物污染并存在生物安全性，故以植物源的有效成份替代动物源成份已成为当前精子冷冻保存技术的一个研究热点，也是精子冷冻保存液实现商业化、标准化生产的一个积极推动因素。

大豆卵磷脂(Soy lecithin)是从大豆中提取的一种两性表面活性的磷脂类物质，与鸡蛋卵黄中具有抗低温打击保护能力的主要功能性成分类似，也不存在生物安全性问题。故大豆卵磷脂在精液冷冻中应用代替卵黄等成份受到许多研究者的关注。在最近十年里，国内外研究者将大豆卵磷脂在牛、马、羊和猪等家畜精子冷冻上进行了大量试验，证实大豆卵磷脂对家畜精子的抗低温打击保护能力与鸡蛋卵黄接近或相当。然而，由于常规加热、超声波等常规辅助促溶手段的局限性，导致大豆卵磷脂添加浓度较低，且溶液呈悬浊液、粒径较大(15.25±9.744μm)，久置会造成沉淀。

而研究已证实，冷冻保存液中存在不规则大颗粒是对精子冷冻效果不利的重要因素之一。一方面，精液冷冻保存液中存在较多不规则的大颗粒，在冷冻过程中使溶液中水分子更容易生成不规则大冰晶，可造成对精子细胞不可逆的机械性损伤；另一方面，较大粒径的大豆卵磷脂也不利于其附着在精子膜表面发挥保护作用。

纳米技术是一门制备和研究结构尺寸在0.1～100nm材料的技术。由于量子尺寸效应和表面效应的缘故，纳米材料会表现新的物理和化学特性。其中，高能球磨机、高压均质机等纳米化手段已开始应用于中草药处理，大大促进了传统中药走向现代化。高压均质法为第二代纳米均质技术，可将以液体为载体的固体颗粒送入工作阀，在低温(0～10℃)、高压条件下，产生强烈的剪切、撞击、空穴和湍流蜗旋作用，从而使溶液中固体颗粒得到超微细化，能大幅度地提高药物溶解性和生物利用度。而对大豆卵磷脂溶液进行纳米化处理还末见有相关报道。

发明内容

本发明首先提供了一种精液冷冻保存液，其含有大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的粒径为133±22nm。

具体的说，本发明的一种精液冷冻保存液，其由如下组分组成：

大豆卵磷脂以及基础冷冻液；

其中大豆卵磷脂的粒径为133±22nm，大豆卵磷脂在基础冷冻液中的添加浓度为2～15％(为质量百分比浓度，优选的浓度为3％、6％、9％、12％和15％)；

其中基础冷冻液为TCG基础冷冻液； 

本发明还提供了制备上述精液冷冻保存液的方法，该方法为：

将大豆卵磷脂溶于基础冷冻液，然后进行纳米化处理。

其中进行纳米化处理是利用高压均质机进行，处理工艺为：4～10℃条件下，压强1500～2000bar。

本发明的精液冷冻保存液经高压均质处理，大幅度降低大豆卵磷脂的粒径，提高其溶解性并增加溶液的稳定性，从而更好发挥其对猪精子的冷冻保护作用。大豆卵磷脂精液冷冻保存液溶液稳定、呈清澈透亮，久置无沉淀产生，利于标准化生产。

附图说明

图1-a实施例2中常规方法制备的大豆卵磷脂冷冻保存液Ⅰ液的粒径分布范围

图1-b实施例2中常规方法制备的大豆卵磷脂冷冻保存液Ⅰ液的粒径颗粒数比例

图2-a实施例1中大豆卵磷脂(6％)冷冻保存液Ⅰ液的粒径分布范围

图2-b实施例1中大豆卵磷脂(6％)冷冻保存液Ⅰ液的粒径颗粒数比例

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1大豆卵磷脂精液冷冻保存液的配制

基础冷冻保存液的配制：

TCG基础冷冻液：葡萄糖1.1g，柠檬酸1.48g,Tris 2.42g，加蒸馏水至100mL，调pH至6.21；

将大豆卵磷脂(Sigma公司产品，货号：P5638)溶于TCG基础冷冻液(50～60℃)中，大豆卵磷脂的添加浓度分别为2％、3％、6％、9％、12％和15％，并充分搅拌然后做超声波处理；

采用高压均质机(广州聚能生物科技有限公司，JN-02C)对大豆卵磷脂冷冻保存液进行纳米化处理，相关参数为4～10℃条件下，压强1500～2500bar，反复处理三次。溶液置于试管密封4℃保存备用。