[发明专利]一种新型无血清培养基在审
申请号: | 201410850189.3 | 申请日: | 2014-12-26 |
公开(公告)号: | CN105779375A | 公开(公告)日: | 2016-07-20 |
发明(设计)人: | 张彦;黎健荣;路玲玉;胡湘丽 | 申请(专利权)人: | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 |
主分类号: | C12N5/071 | 分类号: | C12N5/071 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 201203 上海市浦东*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 新型 血清 培养基 | ||
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体地,本发明涉及一种无血清培养基。
背景技术
随着生物技术的发展,用重组技术制备药物成为可能,人们已可通过克隆编码抗体基因、 然后将该待表达的基因转化到适宜的表达宿主细胞、最后培养宿主细胞、生产和纯化抗体, 从而获得所需的抗体药物。通过该技术,目前已有多种单克隆抗体药物获准上市,包括曲妥 珠单抗(Trastuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、达利珠单抗 (Daclizumab)等等,已广泛应用于治疗包括肿瘤、自身免疫病、移植排斥反应等等多种疾 病,2013年,全球前十大畅销药中,抗体药物已占据了半壁江山,阿达木单抗销售额更是超 过100亿美元。
而在抗体药物制备过程中,细胞的大规模培养是非常重要的一环。细胞培养技术是通过 模拟细胞体内生长环境实现细胞体外培养。通常,动物细胞的生长均有赖于血清的存在.在 普通培养基中,如不加血清,绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在 的污染源,价格昂贵,批间差异大,对生产和科研带来诸多不便。科学家发现在基础培养基 中加入替代血清作用的补充因子,如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等成分, 不少细胞即能在无血清供应的情况下生长。无血清培养基规避了血清带来的风险。便于产品 的分离纯化。然而,一般一种无血清培养基只适用于一类细胞的培养,而且容易受到理化因 素的影响。另外无血清培养基通常含有替代血清的蛋白和脂类,如转铁蛋白、脂类添加剂和 胰岛素等,仍然存在一定的污染风险和分离纯化的障碍,成本也比较高。
CHO(ChineseHamsterOvary)细胞建株于1957年,由DrTheodoreTPuck从一成年雌 性仓鼠卵巢分离获得。此后,CHO工程细胞凭借其具备精细复杂的转录后修饰、较强的外源 基因大量扩增和表达能力,以及易于大规模悬浮培养等优势而成为生产单抗和重组蛋白药物 的首选表达系统,目前被广泛用于生产各种基因工程蛋白产品。通常,CHO细胞的大规模培养 密度很高,但是高秘密贴壁细胞悬浮驯化或细胞高密度悬浮培养过程中常常产生成团现象, 严重的细胞成团可达数毫米,从而影响培养效果。目前细胞悬浮培养成团的机制尚不清楚, 有学者认为死亡细胞释放的DNA在细胞间架桥可能导致了细胞成团,并常伴随细胞代谢转变, 因而无法持续传代培养。为了解决细胞成团难题,各国学者开发了多种解决途径,如提高搅 拌效率、进行长期无血清悬浮培养驯化、降低Ca2+、Mg2+浓度、添加胰酶等等。但是一种更为 有效的避免CHO细胞高密度培养时成团现象产生的方法仍是目前所需要的。
发明内容
本发明的发明人经过大量的实验研究,在DMEM/F12培养基(Sigma公司购买)的基础上 成功开发了一种适用于大规模动物细胞培养的无血清培养基,该培养基成功解决了CHO细胞 高密度培养时成团现象产生难题,另外,该培养基不含血清,且不含动物来源的生长因子、 转铁蛋白和胰岛素等蛋白,从而使细胞受污染的风险大大降低,同时更有利于下游的抗体蛋 白的分离和纯化。具体地,本发明公开了:
1、一种无血清培养基,培养基组分包括,氨基酸、微量元素及无机盐、维生素、碳水化合物 和其他有机分子,其中包括肝素。
2、根据上述1所述的无血清培养基,其特征在于,所述肝素浓度为1.0-50.0mg/L。
3、根据上述2所述的无血清培养基,其特征在于,所述肝素浓度为25.0mg/L。
4、根据上述1-3任一所述的无血清培养基,其特征在于,所述培养基含有甾体激素,而不含 有转铁蛋白和胰岛素。
5、根据上述4所述的无血清培养基,其特征在于,所述培养基含有雌二醇、氢化可的松、柠 檬酸铁、ZnSO4·7H2O,但不含生长因子、转铁蛋白和胰岛素。
6、根据上述5所述的无血清无蛋白培养基,其特征在于,培养基氨基酸的组分和用量如下,
7、根据上述5所述的无血清无蛋白培养基,其特征在于,培养基干粉中微量元素及无机盐的 组分和用量如下,
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