[发明专利]一种用于识别肼的特异性荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于精细化工领域，涉及一种用于识别肼的特异性荧光探针及其应用。

背景技术

肼的化学式为N₂H₄，是一种重要的工业原料,极易溶于水后形成水合肼。肼是一种还原剂,在化学化工、制药工业及农业产业中发挥着重要作用,可用于制备包括催化剂、防腐剂、纺织染料和医药中间体在内的多种工业产品。肼也是一种重要的高能燃料,广泛用于火箭助推系统及导弹系统中。但是肼也具有很强的毒性,在制造、使用、运输和处理过程中容易造成对环境的严重污染。事实上,肼被美国环境保护署(Environmental Protection Agency)划分为人类致癌剂,并对其浓度阈值设定了极其严格的标准:自然水体中肼的溶度不得高于10ppb。作为一种神经毒素及致癌剂,肼会对哺乳动物的肝脏、肾脏和中枢神经系统造成严重的损伤。肼可经口腔吸入或皮肤接触等方式被人体吸收,对人体产生巨大的伤害。因此,实现对水样中微量肼含量的准确监测有重要的生物学及医学意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种识别肼的特异性荧光探针，该探针本身具有蓝色的荧光，与肼反应后产物具有黄色荧光。该探针可用于比色及比率检测实际水相中微量的肼含量。

本发明的技术方案为：一种用于识别肼的特异性荧光探针，所述荧光探针为4-羟基-1,8-萘酰亚胺衍生物，其结构通式如下：

其中R为H或者Br。

所述荧光探针的制备方法包括如下步骤：

(1)按照4-羟基-1,8-萘酰亚胺：三乙胺摩尔比为1:1～2的比例加入到反应瓶中，加入四氢呋喃，冰浴下缓慢滴入酰氯，控制反应温度在0℃，搅拌8-12h；

(2)将上述反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯：正己烷体积比为1:3进行洗脱，得荧光探针。

所述荧光探针应用于生物样本中肼含量的定量评价。该探针作为肼的特异性探针，发生水解反应，通过定量检测水解产物的荧光强度与反应前荧光强度比值来测定细胞中肼的含量。具体测定方法为：

体系中以4-羟基-N-正丁基萘酰亚胺衍生物作为特异性探针；探针浓度选择1～10μM；在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液：DMSO混合溶液(体积比1:9)中，反应温度为20℃至60℃之间，优选25℃为最优反应时间；反应体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；反应时间为5～120分钟；测定水解产物荧光强度作为肼含量的评价指标。

探针本身具有蓝色荧光，其水解产物均具有黄绿色荧光，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长为345nm、450nm，发射波长为420nm、560nm。

本发明的有益效果为：荧光探针为4-羟基-1,8-萘酰亚胺衍生物；按照比例将4-羟基-1,8-萘酰亚胺与三乙胺溶于四氢呋喃中，冰浴下缓慢滴入酰氯，最后采用硅胶色谱法进行纯化，得荧光探针。该荧光探针及相应肼含量检测过程均不受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中肼含量的定量测定。这种荧光探针具有高特异性，可以与肼特异性环化后水解，即酯键断裂的水解产物；廉价易得，可经化学合成获得，合成工艺简单易行；灵敏度高，适合对细胞中肼含量进行检测，通过绘制标准曲线进行肼定量测定。该类探针为比率型探针，有效的避免了探针分布不均匀、环境、激发器等因素对测量结果的影响。

本发明提供了一类4-羟基-1,8-萘酰亚胺衍生物用于特异性识别肼的探针，其与肼反应后可生成波长红移的水解产物。该反应具有高选择性、高灵敏度、反应迅速的特点。该探针可用于比色及比率检测实际水相中微量的肼含量。

附图说明

图1 4-乙酰氧基-N-正丁基-1,8-萘酰亚胺的¹H-NMR谱图；

图2 4-乙酰氧基-N-正丁基-1,8-萘酰亚胺的¹³C-NMR谱图；

图3 4-乙酰氧基-N-正丁基-1,8-萘酰亚胺为探针与不同物质反应后荧光变化结果；

图4 4-乙酰氧基-N-正丁基-1,8-萘酰亚胺为探针与不同浓度肼反应后荧光强度变化曲线；

图5 4-乙酰氧基-N-正丁基-1,8-萘酰亚胺为探针与肼反应荧光强度变化与时间的关系；

图6 4-乙酰氧基-N-正丁基-1,8-萘酰亚胺细胞成像图片(由左到右分别为探针、探针和肼、亮场)。

图7 4-羟基-1,8-萘酰亚胺衍生物结构通式。

具体实施方式