[发明专利]一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，涉及一种用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基以及相应的培养神经干细胞的方法。

背景技术

神经干细胞(NSC)是一类能够自我复制的多潜能干细胞，在一定条件下能够分化成神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞。因其具有治疗多种神经系统疾病的潜能，目前在国际临床试验注册网站上注册的神经干细胞治疗项目已达近900项，主要用于脑瘫，脑中风(脑梗死、脑出血)后遗症、脊髓损伤、运动神经元病、小脑萎缩、共济推敲、帕金森病、视神经萎缩、老年痴呆等多种疾病的治疗。伴随着神经干细胞治疗技术的高速发展，开发一种符合临床使用要求且有快速大量扩增神经干细胞的培养基至关重要。

目前市场上人神经干细胞无血清培养基有较多缺陷，较难用于人神经干细胞规模化生产及临床应用。1、商业化培养基仍含有少量动物源性成份，其具有潜在的病毒感染风险；2、商业化培养基批间差异较大，在前期试验中，我们使用不同批次的目前最好的商业化培养基StemPro NSC SFM贴壁培养胎儿源性的神经干细胞，所培养细胞增殖效率及其鉴定结果表达SOX2等神经干细胞表面标志物差异较大，难于保证所培养干细胞质量；3、此类培养基不具有符合要求的质量标准及检测报告，达不到临床使用要求；4、所培养神经干细胞增殖较慢，难于将来源限制较大的人神经干细胞扩增至足够临床使用的数量；5、该类培养基多适用于神经干细胞悬浮培养，贴壁将导致细胞分化，然而悬浮培养中细胞增殖较慢且培养过程中神经球内部细胞难于得到均匀的营养供应而易衰老或分化，而最终导致细胞存活率及细胞纯度均较低；6、价格较高，限制了神经干细胞规模化生产及应用。

本发明针对以上目前商业培养基中存在的缺陷，完全去除培养基中动物源成分，以重组植物源蛋白和植物源因子取代动物源或人源，并摸索了其使用浓度。最终研制出一种可贴壁培养人神经干细胞的培养基并制订了相关质量标准(草案)及检测方法，用本发明所述培养基贴壁培养人胎儿源神经干细胞，与目前同类商业化培养基相比，能够更快速纯化、扩增人神经干细胞并维持其神经干细胞特性，价格较低，适合干细胞规模化制备及临床应用。

发明内容

本发明目的是解决现有无血清神经干细胞培养基所存在的问题，提供一种可用于贴壁培养人神经干细胞的无血清培养基。

本发明所述的用于贴壁培养人神经干细胞的临床级无血清培养基包括：基础培养基、基础营养添加剂、植物源人血清白蛋白、糖类、脂类、激素、抗氧化剂、促代谢相关物质；其中，所述基础培养基是由商品化的DMEM/F12与商品化的neurobasal培养基按1:1的比例配制而成；所述基础营养添加剂包括：胰岛素、含铁转铁蛋白、脱铁转铁蛋白、腐胺、孕酮、亚硒酸钠；所述激素包括：生物素、皮质酮、硫辛酸、Ve及Ve醋酸酯；所述抗氧化剂包括：人源过氧化氢酶、人源超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、Vc；所述促代谢相关物质包括：肉碱、T3、乙醇胺。

根据本发明所述的无血清培养基的进一步特征，所述培养基的成份及其含量如下：植物源人血清白蛋白：100－3000μg/ml；胰岛素：4－30μg/ml；含铁转铁蛋白：5－100μg/ml；脱铁转铁蛋白：1－5μg/ml；腐胺：10－20μg/ml；孕酮：0.005－0.010μg/ml；亚硒酸钠：0.005－0.010μg/ml；D－半乳糖：1－20μg/ml；脂类：1％；生物素：0.1－0.5μg/ml；皮质酮：0.01－0.08μg/ml；硫辛酸：0.01－0.10μg/ml；VE：1－10μg/ml；VE醋酸酯：1－10μg/ml；人源过氧化氢酶：1－10U/ml；人源超氧化物歧化酶：0.1－1U/ml；谷胱甘肽(抑制)1－10μg/ml；Vc：1－10μg/ml；L－肉碱：1－10μg/ml；乙醇胺：1－10μg/ml；三碘甲状腺原氨酸(T3)：0.001－0.010μg/ml；植物源人bFGF 20－50ng/ml；植物源人EGF 20－50ng/ml；谷氨酰胺：1％。