[实用新型]一种金黄色葡萄球菌肠毒素E的免疫胶体金快速检测试纸条

说明书

技术领域

本实用新型涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素E的免疫胶体金快速检测试纸条，可以实现金黄色葡萄球菌肠毒素E的快速检测诊断，适用于大量样品的现场检测、食物中毒的快速检测与应急处理，属于免疫检测技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病菌，金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黄色葡萄球菌食物中毒的95%。

在食品加工过程中，经过热处理可以杀灭金黄色葡萄球菌，然而一旦菌体产生外分泌的肠毒素，那么存在于食物中的肠毒素非常稳定，100℃ 30min不被破坏，摄入人体后可以抵抗肠胃液中蛋白酶的分解，并引起人体的呕吐、腹泻等症状。2011年我国公布速冻面米制品新国标GB19295—2011，金黄色葡萄球菌由原来的不得检出变为限量检出，因此为了杜绝食品中金黄色葡萄球菌活菌数合格而肠毒素超标的情况，肠毒素的快速检测对于保障食品安全具有更加重要的意义。

近年来，ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点越来越多地用于肠毒素的检测，但胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，因此对于大量样品的现场检测、食物中毒的快速检测具有重要的意义。

实用新型内容

本实用新型目的在于提供一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素E的免疫胶体金快速检测试纸条，操作简单，快速方便，灵敏度高，稳定性好，成本低廉。

本实用新型适用于海关、企业、医院、检验检疫单位等，可实现食品或临床样本中金黄色葡萄球菌肠毒素E的快速检测。

本实用新型的技术方案，一种金黄色葡萄球菌肠毒素E的免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板，在PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；

PVC底板中部设置有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设置有金标垫；所述金标垫一端与样品垫相连接叠放，另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层上；

所述硝酸纤维素膜检测层上依次设置有检测线和质控线。

所述金标垫包被有金标标记抗SEE抗体1E5（CGMCC No.7214）。所述检测线上包被有抗SEE抗体2E3（CGMCC No.7215）。所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。

所述金黄色葡萄球菌肠毒素E的免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，金黄色葡萄球菌肠毒素E缩写为SEE，步骤为：

（1）抗SEE特异性单克隆抗体的制备：

以北京军事医学科学院提供的重组表达的SEE为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个细胞株；

（2）特异性SEE双抗体检测抗体的筛选：

将步骤（1）纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行双抗体夹心法配对，确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需要抗SEE抗体；其中1E5为金标抗体，2E3为包被抗体；

（3）金黄色葡萄球菌肠毒素E免疫胶体金快速检测试纸条的制备：

a、空白胶体金的制备：

采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL质量浓度为1%的氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL质量浓度为1%的柠檬酸钠，继续加热15~20分钟，至呈亮红色，然后室温中冷却，4℃冷藏保存；

b、胶体金标记抗体的制备：

空白胶体金溶液用0.1M K₂CO₃调节PH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度抗体，每毫升空白胶体金溶液加入30μg抗体1E5（CGMCC No.7214），继续搅拌30分钟，离心，吸取上清，用金标抗体保存液重旋；

c、金标垫的制备：

调试三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将标记好胶体金的抗SEE抗体1E5（CGMCC No.7214）均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6μL /cm，37℃ 烘干过夜，封袋备用；

d、包被膜的制备：

调试三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将稀释好的抗SEE抗体2E3（CGMCC No.7215）均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠IgG均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.6μL /cm，37℃ 烘干过夜，封袋备用；

将PVC底板、硝酸纤维素膜检测层、样品垫、金标垫、检测线、质控线和吸水垫组合，即得产品金黄色葡萄球菌肠毒素E的免疫胶体金快速检测试纸条。