[实用新型]用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子细胞生物学领域，涉及一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒。

背景技术

利用现代免疫和分子技术，恶性肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞根据其细胞学特征可以被检测出来。能够方便的检测和定位这样的细胞将会对恶性肿瘤早期诊断，化疗调整，早期复发的预防和靶向治疗产生深远的影响。当1889年StevenPaget发表了关于“种子和土壤”的学说后，血液播散细胞的想法应运而生。一个多世纪以后，随着分子技术的成熟，新的临床发现解释了曾经不能解释的现象，比如远处器官出现另外和原位瘤同样病理特征的肿瘤，对于上皮细胞起源的实体瘤，许多病人的外周血中都可以检测到循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞不仅存在于已经发生肿瘤远处转移的患者，同样也存在于那些肿瘤尚局限的患者。特别值得注意的是，这种方法在恶性肿瘤化疗调整的风险评估和利用循环肿瘤细胞的分子学特征研究新的靶向治疗具有很重要的意义。

研究目前所存在的检测技术大多是在大剂量化治疗前，抽取骨髓或提取单个核细胞来检测微小转移是否发生。抽取骨髓耗时较长，而且对患者而言有一定的痛苦，事实上，现在临床对于乳腺癌的治疗已经很少用到大剂量的化疗了。因此，现阶段很多研究都比较关注外周血循环肿瘤细胞的检测，不过检测的基本原理几乎还是相同的。用于检测循环肿瘤细胞的方法大体上可以分为两类，一类是细胞计数分析，一类是核酸检测。细胞计数法是根据免疫细胞化学技术来鉴定和确定个体肿瘤细胞的特征。核酸检测技术是通过检测肿瘤细胞和正常人细胞中不同个体肿瘤细胞的特征。核酸检测技术是通过检测肿瘤细胞和正常人细胞中不同表达的DNA或RNA序列来实现的。

细胞计数法为通过提取和计数个体细胞来实现。该方法的一个优势在于可以通过其表达的关键的生物标志，如人上皮生长因子受体-2(HER2)和上皮生长因子受体(EGFR)，进一步分析细胞分子水平的生物学特征。尽管如此，即便是在已经发生转移的肿瘤患者外周血中也只能检测到很少数量的上皮细胞(小于10个细胞/ml)，所以在这些细胞从血液成分中分离出来前需要进行富集。

许多研究者已经通过免疫磁珠的方法来进行细胞富集。通常市面上可以买到的试剂盒或常规方法包括磁性吸引细胞分选系统(MACS系统)、磁珠、以及铁磁流体系统。MACS系统和磁珠系统都通过抗体连接到顺磁体磁珠上，通过不同的磁性吸引来分选特定的细胞。磁珠可以连接到阳性选择的抗上皮细胞抗体上(如HEA125，cytokeratin7/8,BerEP4)或者直接连接到单克隆抗体CD45，来选定阴性表达的白细胞。从发生转移的乳腺癌患者外周血中分离得到的cytokeratin阳性细胞。通过免疫磁性法富集分离血细胞，染上抗cytokeratin8/18,生物素，异硫酸氢盐荧光素(绿色荧光)。细胞核用碘化丙啶染色(红色荧光)。其他的富集方法包括密度梯度离心和滤器滤过方法。滤器滤过是根据白细胞直径大小，允许较小的白细胞通过，而较大的肿瘤细胞留在了滤器内。

尽管对细胞进行富集，但上皮细胞仍然大大小于残留的白细胞的数量，因此，我们需要更进一步的检测到这些上皮细胞。免疫化学方法是建立在利用单克隆抗体抗各种上皮细胞抗原的基础上。利用免疫化学技术来扫描大量的细胞是相当耗时的；自动化成像分析系统或者半自动分选技术如流式或激光扫描细胞计数是比较适合的。本方法采用单一的肿瘤相关抗原的检测，特异性和灵敏性稍低。

采用核酸检测技术，即在肿瘤患者的血液中可以检测到与肿瘤相相关的关的DNA/mRNA，然后可以用采用PCR/RT-PCR的方法检测,方法学涉及到几个步骤，具体步骤为，首先采用密度梯度离心法从外周血中提取单个核细胞，或采用免疫磁性分离技术从外周血中富集上皮细胞，然后采用标准方法提取细胞中的核酸，最后通过特异性引物PCR扩增。该方法缺乏细胞形态的支持，特异性低。

实用新型内容

为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒，可以快速、简便、准确地检测外周血循环肿瘤细胞。