[实用新型]一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型涉及酶联免疫试剂盒测试技术领域，尤其是一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒。

背景技术

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的野生珍稀动物，被誉为中国的“国宝”。现有野生大熊猫的数量在1600只左右，人工圈养的大熊猫仅有l90只左右，但它们仍处于绝灭的边缘。天敌危害、疾病侵袭、食物缺乏、栖息地缩小及繁殖能力低下等是造成大熊猫趋于濒危的原因，而在大熊猫疾病中，寄生虫病占有极其重要的位置。其中，又以西氏贝蛔虫对大熊猫的危害最大。西氏贝蛔虫是引起大熊猫疾病的重要原因之一，感染率高，诊断主要以传统的粪便漂浮虫卵法及驱虫药驱出虫体从而检测是否有西氏贝蛔虫的感染。虽然粪便漂浮沉淀法检测简便易行，但是在感染度较低的情况下，虫卵检测的敏感性也明显降低。

近期也有研究者从大熊猫粪便中提取DNA，从而根据西氏贝蛔虫线粒体基因组序列设计引物，PCR扩增蛔虫虫卵DNA，期望从分子水平上建立了诊断大熊猫感染西氏贝蛔虫的情况。而对于该蛔虫在感染的早期阶段例如幼虫移行期阶段等尚无诊断方法，加之大熊猫这一特殊的物种，因此运用病原学及PCR诊断方法存在局限。

本研究以小鼠为模型，利用感染该蛔虫的小鼠阳性血清和阴性血清、西氏贝蛔虫重组蛋白为抗原构建一种操作简单，快速、敏感的ELISA免疫学检测试剂盒及其方法，且对该重组蛋白的检测价值进行评估，为以后建立诊断大熊猫西氏贝蛔虫感染的方法做基础，尤其是对潜伏期的西氏贝蛔虫感染的检测。

实用新型内容

本实用新型目的是提供一种操作简单，快速、敏感的检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒。

实现本实用新型的技术解决方案是，一种检测大熊猫西氏贝蛔虫的酶联免疫试剂盒包括：

所述试剂盒中含有包被重组抗原构成的酶标板，酶标二抗，小鼠阴性对照血清，感染西氏贝蛔虫小鼠阳性对照血清，底物溶液，洗涤液，其中，所述包被重组抗原为重组蛋白 rBs-GST-1；所述酶标二抗为羊抗鼠-HRP二抗，以上液体均分装在试剂盒中。

所述的酶联免疫试剂盒，所述重组蛋白rBs-GST-1是通过克隆、表达大熊猫西氏贝蛔虫的Bs-GST-1蛋白而获得的重组rBs-GST-1蛋白。

所述的酶联免疫试剂盒，所述重组蛋白rBs-GST-1能与西氏贝蛔虫感染的小鼠阳性血清发生免疫反应，具有反应源性。

进一步的所述酶联免疫试剂盒，所述重组抗原的包被稀释度达到1:12800时，OD₄₅₀值显著。

进一步的所述酶联免疫试剂盒，所述对照阳性血清稀释度达到1:12800，抗原包被稀释度为1:12800时，OD₄₅₀值显著。

更进一步的所述酶联免疫试剂盒，所述酶标二抗，其在50min时，稀释度1:3000时OD₄₅₀为0.987，且P/N值最大。

更进一步的所述酶联免疫试剂盒，上述的重组蛋白rBs-GST-1按照以下方法制备，步骤包括：

(1)Bs-GST-1基因的扩增：采用高通量测序技术获得的西氏贝蛔虫基因组和发育转录组数据，鉴定和筛选出编码Bs-GST-1的转录本，然后以此为模板利用Primer 5.0软件设计特异性PCR扩增引物：

上游引物：5’-AAGCAACATGCCGCAGTACAAG-3’；

下游引物：5’-CACAAAAAACAGAATAGACCCTAATA-3’；

经PCR扩增出Bs-GST-1基因，测序得到长647bp片段序列，其ORF框长为621bp；

(2)利用DNAStar软件分析出表达序列蛋白分子量是22.65915kDa，理论等电点pI为7.449；

(3)氨基酸序列分析、结构预测：利用DNAStar软件对西氏贝蛔虫GST-1蛋白进行氨基酸序列分析，编码为199个氨基酸；其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(4)GST-1基因的克隆载体构建：设计加酶切位点引物，通过PCR扩增出约600bp大小的片段；

(5)重组质粒的酶切；通过设计的两个酶切位点引物对重组质粒pMD19-T-GST-1进行提取；

(6)表达载体的构建；将上述质粒通过胶回收后与原核表达载体pET-32a(+)连接，构建pET32a(+)-GST-1重组表达质粒，转化入表达菌BL21中，经单菌落PCR鉴定与测序， 并扩大培养提取质粒，再次双酶切鉴定，从而确定表达载体构建成功；