[发明专利]生物物质的实时定量及定性分析方法

权利要求书

1.一种生物物质的实时定量及定性分析方法，包括如下步骤：

(a)准备生物物质检测用元件，该生物物质检测用元件包括上部形成有开口部的反应容器和通过所述开口部而可装卸于所述反应容器的元件部，其中所述元件部包括结合于所述反应容器的开口部的盖和朝所述盖的下部延伸而形成的杆，所述杆具有表面固定有第三探针的生物芯片；

(b)向所述反应容器内添加包含第一探针-第二探针复合体、正向引物、反向引物、碱磷酸去氧核苷酸、具有外切核酸酶活性的聚合酶、包含靶基因的样本及缓冲溶液的反应溶液，其中，所述第一探针包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，且包含能够产生第一荧光信号的第一荧光体和能够猝灭所述第一荧光体的第一猝灭体，所述第二探针包含互补于所述第三探针的寡核苷酸序列，而不包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，所述正向引物及所述反向引物是为了扩增所述样本内靶基因而包含互补于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物；

(c)进行包含所述样本内靶基因的变性反应、所述样本内靶基因和所述复合体、所述正向引物及所述反向引物的杂化反应以及由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的所述引物的延长反应的聚合酶链反应，其中，通过所述杂化反应而仅在所述靶基因和所述复合体中的所述第一探针之间进行杂化反应，在进行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延长反应的期间，从所述复合体分解并释放所述第二探针及所述第一荧光体；

(d)被释放的所述第二探针和固定于所述生物芯片的所述第三探针进行杂化之后通过所述聚合酶而所述第二探针在所述第三探针上延长，其中，所述第三探针包含能够产生第二荧光信号的第二荧光体和能够猝灭所述第二荧光体的第二猝灭体，随着所述第二探针在所述第三探针上延长，第二猝灭体从所述第二荧光体分开而产生发光；以及

(e)检测由所述第一荧光体引起的第一荧光信号以及由所述第二荧光体引起的第二荧光信号。

2.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，将所述反应溶液添加为使设置于杆的生物芯片浸渍于反应溶液中。

3.根据权利要求2所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述生物芯片设置于选自所述杆的外周面以及下部的至少一个区域，

其中，设置所述生物芯片的至少一个区域以浸渍于所述反应溶液的状态存在。

4.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述第三探针通过第三探针的5'末端或3'末端的高分子物质固定于所述生物芯片。

5.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述反应溶液中具有外切核酸酶活性的聚合酶以每反应为在0.1单位～1单位的范围内选择的量来使用。

6.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述反应溶液中第一探针-第二探针复合体以每反应为在0.5pmole～10pmole的范围内选择的量来使用。

7.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述反应溶液中所述正向引物及所述反向引物以对称或非对称浓度来使用。

8.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，所述步骤(c)是在所述反应溶液内进行。

9.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，所述反应溶液内不存在被分解而释放的第二探针。

10.根据权利要求1所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，所述第一荧光体被第一猝灭体而处于猝灭状态，所述第二荧光体被第二猝灭体而处于猝灭状态。

11.根据权利要求10所述的生物物质的实时定量及定性分析方法，其特征在于，在所述样本内不存在具有与所述第一探针互补的序列的靶基因的情况下，不发生由所述第一荧光体引起的第一荧光信号及由所述第二荧光体引起的第二荧光信号。