[发明专利]一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用。

背景技术

神经性疾病是危险人类健康的重大疾病，这些疾病大多数是由于神经细胞发生了不可替代的损失而所致，传统的治疗方法很难进行治疗，而神经干细胞的修复再生为治愈这些疾病提供了可能。

神经干细胞在脑部的发育过程中主要经过两个不同的发育阶段，即神经上皮干细胞(neuroepithelial stem cells)、放射胶质前体细胞(radial glial progenitor cells)。神经上皮干细胞是最早期的神经干细胞，具有更强的分化多能性，能分化发育为整个脑部细胞。而且神经上皮干细胞具有很强的增值能力，产生高纯度的神经元，具有重要的科学和临床应用价值。

但是，在相关技术中，传统的神经干细胞培养方法主要采用生长因子bFGF和EGF组合而成，这种培养体系只能培养发育后期的神经前体细胞(放射胶质前体细胞)，而不能长期稳定培养神经上皮干细胞，并且培养的放射胶质前体细胞随着培养时间的延长，细胞特性以及分化的多能性产生显著的变化，失去神经细胞的分化能力，因此不能进行干细胞的规模化生产，限制了其临床干细胞替代治疗、疾病机制以及药物筛选中的应用。

综上，通过体外培养建立一种能够稳定传代的神经上皮干细胞是本领域亟待解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种建立神经上皮干细胞的培养基，包括；

用于将多能干细胞诱导分化为初级神经上皮干细胞的分化培养基以及用于使所述初级神经上皮干细胞扩增的扩增培养基；所述分化培养基包括：Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、bFGF、Wnt信号通路的激动剂(GSK3的抑制剂)、TGF-β信号通路的抑制剂、Notch信号通路抑制剂、ALK2以及ALK3信号通路的抑制剂；所述扩增培养基包括：Neurobasal培养基、B-27添加剂、N-2添加剂、bFGF、Wnt信号通路的激动剂(GSK3抑制剂)、TGF-β信号通路的抑制剂和白血病抑制因子。

本发明提供的这种建立神经上皮干细胞的培养基，包括分化培养基和扩增培养基，分化培养基中含有多种可供多能干细胞分化为初级神经上皮干细胞所需的营养成分；其中，bFGF可以促进神经干细胞的早期分化和增殖，Wnt信号通路的激活(通过Wnt信号通路的激动剂)有利于神经干细胞的增殖，抑制TGF-β信号通路促进多能干细胞往神经细胞的定向分化，Notch信号通路的抑制能够快速的促进多能干细胞往神经细胞以及神经干细胞往神经元的定向分化，ALK2和ALK3信号通路的抑制将抑制BMP4信号通路，促进多能干细胞往神经细胞以及神经干细胞往神经元的定向分化。

因此，通过含有上述组成的分化培养基即可使得多能干细胞分化成为初级神经上皮干细胞；然而初级神经上皮干细胞虽然具备神经上皮干细胞的机能，但是其在传统的培养条件下，仍然不能长期稳定的扩增，因此，其再通过扩增培养基进行长期稳定培养，其中，扩增培养基中所含的bFGF、Wnt信号通路的激动剂(GSK3抑制剂)、TGF-β信号通路的抑制剂均具备使初级神经上皮干细胞保持其特性并稳定扩增的功能；此外，白血病抑制因子具有调节细胞增殖和分化的功能。通过扩增培养基即可将初级神经上皮干细胞培养成稳定扩增和存活的，以及能够规模化生产的神经上皮干细胞。

可选的，在所述分化培养基中，所述Wnt信号通路的激动剂和GSK3的抑制剂均为CHIR99021；所述TGF-β信号通路的抑制剂为SB431542；所述Notch信号通路抑制剂为Compound E；所述ALK2以及ALK3信号通路的抑制剂为LDN193189；

和/或在所述扩增培养基中，所述Wnt信号通路的激动剂和所述GSK3抑制剂均为CHIR99021；所述TGF-β信号通路的抑制剂为SB431542。

可选的，在所述分化培养基中，所述bFGF的浓度为3-100ng/ml；所述CHIR99021的浓度为0.3-30μM/l，所述SB431542的浓度为2-50μM/l；所述Compound E的浓度为0.05-10μM/l；所述LDN193189的浓度为0.1-10μM/l；