[发明专利]耐热性纤维二糖水解酶

说明书

本发明的耐热性纤维二糖水解酶至少在75℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性，是由序列号1、3、5或7所示氨基酸序列构成的多肽，是由序列号1、3、5或7所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的多肽，或者是由与序列号1、3、5或7所示氨基酸序列具有80％以上且不足100％的序列一致性的氨基酸序列所构成的多肽。

技术领域

本发明涉及纤维二糖水解酶的耐热性。纤维二糖水解酶是水解纤维素、半纤维素等木质纤维素而生成单糖的过程中涉及的糖苷水解酶的一种。更具体而言，本发明涉及一种新耐热性纤维二糖水解酶、编码该耐热性纤维二糖水解酶的多核苷酸、用于表达该耐热性纤维二糖水解酶的表达载体、整合了该表达载体的转化体、以及使用该耐热性纤维二糖水解酶的纤维素分解产物的制造方法。

本申请要求2013年3月27日提交的国际申请号为PCT/JP2013/059028号的国际申请的优先权，并在本文中引用其内容。

背景技术

除地球温暖化和大气污染等环境上的问题之外，出于对原油价格的大幅上涨、以及不久的将来的原油枯竭的预想(石油峰值论)等运输用能源供应的担忧，近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质或木质纤维素是地球上最丰富的可再生能源，作为石油替代资源而备受期待。生物质干重的主要成分为纤维素、半纤维素等多糖类以及木质素。例如，多糖类被统称为纤维素酶的糖苷水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖后，用作生物燃料或化学品原料。

具有复杂结构的木质纤维素是难分解性的，难以用单一的酶分解或糖化。对于木质纤维素的全分解，通常需要糖苷水解酶中的内切葡聚糖酶(纤维素酶或内切-1,4-β-D-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)、外切型纤维二糖水解酶(1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)或纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)、β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)这三种酶。对于木质纤维素的水解，据认为另外还需要适当添加作为半纤维素酶的木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶，EC 3.2.1.8)、以及包括其他植物细胞壁 分解酶的多个酶。

在以木质纤维素为资源制造生物乙醇时，以乙醇的高能效转化为目的，尝试了基于高固体负荷(30～60％的固体负荷)的糖化处理。这种基于高固体负荷的糖化虽然生物质糖化液的粘性高、难以进行酶促反应，但是通过在高温下进行，使生物质糖化液的粘性降低，结果有望实现缩短糖化反应时间和降低酶量。此外，根据范特霍夫-阿伦尼乌斯规则(van’t Hoff-Arrhenius)，通常化学反应的温度上升10℃，反应速度增加2-3倍。因此，以与传统相比更高的温度使用耐热性纤维素酶进行木质纤维素糖化处理时，遵从该经验规则应该可获得快的酶反应速度。由上述理由可以认为，通过使用耐热性酶在高温下进行木质纤维素糖化处理，可以大幅降低酶量和糖化时间，减少酶的成本。

作为真核生物的嗜热丝状真菌与作为原核生物的嗜热菌和超嗜热古细菌相比，其生存极限温度低，为55℃左右。因此，嗜热丝状真菌表达分泌的糖苷水解酶的耐热性通常不是很高。在目前的报导中来源于耐热性最高的丝状真菌的CBH(纤维二糖水解酶)，嗜热丝状真菌嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的纤维二糖水解酶CBH Ⅰ、CBH Ⅱ表现出的最适温度分别为75℃和70℃(例如参照非专利文献1)，嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的纤维二糖水解酶CBH Ⅰ的最适温度为65℃(例如参照非专利文献2。)。虽然有通过取代纤维二糖水解酶中的一个或多个氨基酸来进一步提高耐热性的方法(例如参照专利文献1或2。)，但是这样获得的突变型纤维二糖水解酶的耐热性仍然不足。