[发明专利]氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于重组产生多肽的用途

说明书

本发明是重组多肽产生的领域。本文更精确地报道了使用营养缺陷型恢复的原核菌株在化学成分明确的基础生长培养基中重组产生非糖基化多肽的方法。

发明背景

近年来，治疗性多肽的生产稳步增加并且很可能的是在不久的将来治疗性多肽将成为可用于治疗多种疾病的最大治疗组。治疗性多肽的影响来自其特异性，如特定的靶标识别和/或结合功能。

细胞培养用于发酵过程中以产生物质，特别是多肽。在其中细胞培养物未被遗传修饰并且形成其自身的代谢产物的过程与其中生物以它们产生更大量的其自身物质如多肽或产生外源物质的这种方式被遗传修饰的过程之间进行区分。利用保证生物存活并使得能够产生想要的靶标化合物的营养培养基供应产生物质的生物。许多培养基因使得能够最优培养特定宿主的这些目的而闻名。

化学成分明确的基础生长培养基在培养重组细胞中用于重组产生治疗性多肽中的使用是有利的。其使得能够为所产生的治疗性多肽容易地开发下游加工和纯化，由于最小化的原材料差异提供最稳健的生产过程并降低产品成本。

化学成分明确的基础生长培养基不包含游离氨基酸，并且其需要使用原养型的细胞系，其具有完整的代谢途径以从化学成分明确的基础生长培养基的可用成分产生所需的氨基酸。

例如，当大肠杆菌(E.coli)用作宿主细胞系时，一般使用野生型菌株，如MG1655、W3110或BL21。这些菌株显示良好的生长特性，但是较次等的产品效价。

当与野生型菌株相比时，通过非定点诱变和选择已获得的突变体原核菌株在其基因组DNA中显示明显差异。已经基于可以获得的最大产物效价选择了突变株。因为突变株携带许多营养缺陷型，所以它们不能用于在化学成分明确的基础生长培养基中培养。突变株需要氨基酸的补料以补偿其营养缺陷型，导致增加的培养成本。

US 5,932,439报道了大肠杆菌(Escherichia coli)K-12菌株用于产生重组蛋白质。

发明概述

通过恢复营养缺陷型原核菌株其一种或多种营养缺陷型，所述营养缺陷型恢复的菌株可以在化学成分明确的基础生长培养基上生长，其中不再需要向所述化学成分明确的基础生长培养基中加入对应于已经恢复的营养缺陷型的物质。在昂贵物质的情况下，可以实现产品成本的降低并且可以更经济地产生重组多肽。

除了在缺少对应于已经恢复的营养缺陷型的物质的情况下恢复在化学成分明确的基础生长培养基上生长的能力外，已经发现与未恢复的菌株相比，可以维持或甚至增加可获得的产物效价。此外已经发现使用营养缺陷型恢复的原核菌株可获得的产物效价高于利用对应的原养型野生型菌株可获得的产物效价。

不希望受该理论束缚，当与对应的原养型野生型菌株(其中未曾进行该缺失和恢复)相比时，假定本文报道的氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株具有不同的代谢和代谢流。因此，原核菌株内某些酶的失活和再激活对菌株的完整代谢具有可检测的/显著的影响，其例如可以在与对应的原养型野生型菌株相比该菌株的增加的生产力中看到。

本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株，其特征在于

-已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和

-菌株可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢复的营养缺陷型的氨基酸。

在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株。

本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株，其特征在于

-已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和

-细胞可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。

在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核细胞是营养缺陷型恢复的大肠杆菌细胞。

本文报道的营养缺陷型恢复的原核菌株/细胞可以用于重组产生治疗性多肽的方法中，其中与非营养缺陷型恢复的原核菌株/细胞相比，不需要补充至少一种氨基酸残基。

本文报道的一个方面是用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：