[发明专利]用于检测A类、B类、C类及D类β-内酰胺酶基因的菌落多重PCR用的引物和试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提供供用于检测A类、B类、C类和D类β‑内酰胺酶基因的菌落多重PCR用的试剂盒和引物。通过使用根据本发明的试剂盒和引物快速检测bla基因允许开出适当抗生素处方，这可以降低患者的死亡率并使抗生素抗性减至最低。本发明提供用于快速和准确分子方法的试剂盒和引物，所述方法(a)用以检测所有临床上重要的bla基因以及(b)用以通过使用54个引物对来充分解释表型试验结果，所述引物经由新型和精巧的优化方法来设计。在172种对照菌株和403种临床菌株中，以完美的特异性和灵敏性，本发明提供鉴别细菌性病原体中的所有bla基因的迅速和临床应用。

技术领域

本发明涉及一种用于检测β-内酰胺酶基因的引物对。本发明还涉及用于检测β-内酰胺酶基因的试剂盒。

背景技术

在病原菌中的多重抗生素抗性的出现和传播是全球性的健康危机¹。β-内酰胺抗生素是用于治疗细菌感染的最成功的药物之一并且占据了全球抗生素市场总额的大约65％²。因此，通过获得编码β-内酰胺酶的基因所致的对β-内酰胺抗生素的抗性是如以下的革兰氏阴性病原菌中最严重的问题之一：各种肠杆菌科、假单胞菌属以及鲍氏不动杆菌中的菌^3,4。在1940年公开了观察β-内酰胺酶的首篇报告之后⁵，也就是引入首个商用抗生素(青霉素)的前一年，超过1,200个不同的β-内酰胺酶(bla)基因已经在临床菌株中得到鉴别，显示了bla基因由于其连续突变所致的显著多样性⁴。所述bla基因基于其氨基酸序列和官能团可被分成4种主要类别A-D。A类、C类及D类酶利用丝氨酸用于β-内酰胺水解，而B类金属酶需要二价锌离子用于底物水解⁴。在这些酶中，吸引最多临床关注的β-内酰胺酶是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)，其水解大多数青霉素和第三或第四代具有氧亚氨基侧链的头孢菌素；以及碳青霉烯酶，其可水解几乎所有β-内酰胺类，包括碳青霉烯类^6-8。具有ESBL基因和具有碳青霉烯酶基因的革兰氏阴性病原体是造成死亡率增加和严重的医院爆发的原因，这提出了严重的治疗和感染控制挑战^3,7。

发明内容

技术问题

为实现爆发的早期检测并使耐药菌传播减至最小，用于检测抗性基因的快速诊断方法的可用性也是非常重要的。使用经典的基于培养的表型试验测定易感性或抗性是临床微生物实验室中使用的一般方法，但此项工序耗时并且不容易检测到由肠杆菌科引起的ESBL和碳青霉烯酶产生，这是由于酶表达的可变水平以及一些抗生素组合的不良特异性^9,10。相反，基于分子的诊断方法的实施轻易克服了这些限制并且可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对于感染控制和在医院和社区环境中的治疗选择是重要的⁹。然而，先前开发的用于bla基因检测的方法受限于若干bla基因的鉴别并且用于检测所有临床上重要的bla基因的分子诊断方法是不可用的^11-17。因为这些方法仅可以检测部分类型的bla基因，所以其不能代替易感性测试。

为了解决这类问题，本发明人设计了即用型的54个PCR引物对，其最佳特征在于容易用于以完美的特异性和灵敏性快速和准确地检测所有临床上重要的bla基因。此大规模bla检测方法(被命名为_LARGE-SCALEblaFinder)可快速和准确地以低成本测定临床菌株的bla基因分型且因此可以帮助使抗生素抗性减至最小。显而易见的是，_LARGE-SCALEblaFinder检测先前研究的菌株中的24个额外的未报道的bla基因，表明此方法具有检测存在临床菌株中的所有bla基因的能力。

问题的解决方案