[发明专利]表征溶酶体酶的方法

说明书

相关申请

本申请要求于2013年3月13日提交的美国临时申请序列号61/779,767的优先权，所述临时申请的公开内容以引用的方式并入本文。

背景

乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)是与硫酸乙酰肝素降解有关的溶酶体酶。导致缺乏这种酶的遗传缺陷称为IIIA型粘多糖症或A型圣菲力浦疾病。这种罕见常染色体隐性疾病在活产新生儿中的发生率为1/24,000，并且没有被批准的医学治疗方法可用。目前在临床上正在评估酶替代疗法(ERT)，其中将重组形式的外源酶引入受试者体内以弥补由遗传突变导致的酶缺乏。具体地说，可以将重组HNS酶引入诊断为A型圣菲力浦疾病患者体内，以促进硫酸乙酰肝素的降解和生物转换。为了进行治疗，通常使用基于细胞的表达系统来产生重组HNS糖蛋白。通常，重组酶是包含5个潜在的N-糖基化位点以及若干用于翻译后修饰的附加位点的54.7kDa糖蛋白。这些修饰结构中的一些结构，诸如带有末端甘露糖-6-磷酸者，对于生物功效来说是重要的，而另一些可能在蛋白质稳定性和/或溶解性中有作用。由此，受到上游细胞培养和下游纯化过程两者影响的存在于最终重组产品中的不同糖形的多样性可以对治疗性酶的潜在功效、药效学和药代动力学参数产生较大影响。

因此商业环境中的重组蛋白质治疗剂的生产需要控制制造过程，所述制造过程涉及一系列灵敏分析方法以阐明产品的生理化学特性和监测其纯度、稳定性和/或活性。检测出纯化的批次之间的细微的生理化学差异的能力对于实现受控的可靠生产过程以及一致、安全且有效的产品是很重要的。

发明概述

本发明特别提供改进的方法来阐明重组乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)蛋白质的重要生理化学特性，从而允许更有效地监测和控制由商业制造过程生产的产品的质量、纯度和稳定性。因此，本发明允许更可靠的生产过程以及用于对A型圣菲力浦疾病进行有效的酶替代疗法的一致、安全且有效的产品。可预料的是，本发明可适用于任何溶酶体酶。

部分地，本发明是基于以下发现：毛细管区带电泳可以用于精确表征编码与溶酶体贮积病相关联的酶的重组蛋白质的生理化学特性。在一些具体实施方案中，重组蛋白质编码HNS酶。可预料的是，溶酶体酶(即，HNS蛋白质)的一种生理化学特性，分子电荷，是一种特别重要的属性。电荷微观异质性的程度可以归因于蛋白质结构的修饰(即，脱酰胺作用)和/或连接至多肽链的碳水化合物部分。重要的是，分子电荷(即，带电碳水化合物结构)的程度已经显示出在HNS蛋白质的生物功效和血清半衰期以及蛋白质抗原性、溶解性和蛋白酶抗性方面具有重要影响。因此，重组溶酶体酶(如HNS)的天然电荷异质性的定量分析和表征是产品开发的重要部分。

已知多种用于监测天然电荷异质性的不同分析技术，包括离子交换色谱法(IEX-HPLC)、凝胶电泳等电聚焦(gel-IEF)、毛细管等电聚焦(cIEF)、成像cIEF和毛细管区带电泳(CZE)。虽然这些技术各自都提供优点和劣势，但是用于解决指定蛋白质的电荷异质性的最佳方法将根据具体情况而确定。如下文实施例部分所描述的，本发明表明毛细管区带电泳特别适于表征溶酶体酶(如HNS)的天然电荷和聚糖分布，从而提供一定测定条件范围内的高水平的再现性和稳定性。因此，本发明允许任何溶酶体酶的商业生产的标准化和最优化。例如，这种方法可用于特别重组的HNS蛋白质。虽然HNS蛋白质用作实施例中描述的CZE分析的实例，但是可以预料的是，本发明可以应用于任何溶酶体酶。

在一个方面中，本发明提供分析溶酶体酶(如乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白质)的方法，其包括通过毛细管区带电泳来表征酶的电荷分布。在一些实施方案中，溶酶体酶是重组产生的。在一些实施方案中，表征步骤包括通过毛细管区带电泳分离对应于电荷变化的峰群的步骤。

在一些实施方案中，电荷分布包括少于14个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括至少14个对应于电荷变体的存在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括至少14、15、16、17、18、19、20或21个对应于电荷变体的存在的群。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与甘露糖6-磷酸(M6P)的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸和/或甘露糖6-磷酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变体。