[发明专利]使用杂合CHEF1启动子的改善重组蛋白表达

说明书

本发明提供用于高水平表达重组蛋白的表达载体和宿主细胞。所述表达载体包含中国仓鼠卵巢延长因子1‑α(CHEF1)转录调控DNA元件和巨细胞病毒(CMV)启动子和/或人腺病毒三联前导(AdTPL)序列。与以前描述的表达系统相比，本发明实现宿主细胞的增加蛋白表达和更好的产率。

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相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年3月12日提交的美国临时专利申请序列号61/777,603的优先权的权益。所述优先权申请的公开内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明针对包含新颖启动子-增强子组合的表达载体，所述启动子-增强子组合增强异源蛋白表达并且在重组蛋白生产的领域中具有实际应用。

背景技术

通过转录、翻译、蛋白质折叠和/或分泌中的改善而增加的重组蛋白表达是基本优先的用于在细胞系发展期间优化产量。中国仓鼠卵巢延长因子1-α(CHEF1)表达系统已经被广泛使用以创建用于产生重组蛋白的临床细胞系。延长因子1-α(EF-1α)基因在大多数组织类型中高度表达，并且EF-1是人细胞中最丰富的蛋白质之一(Beck等，Molecular SystemsBiology 7:549；2011)。CHEF1表达载体实现在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中以及在非仓鼠细胞中的高水平重组蛋白表达。

CHEF1表达与生长相协调，使得滴定度增加由增加的体积产率来驱动。通常，蛋白表达在生长的指数期早期启动并且在静止期期间下降且衰退。蛋白表达和细胞生长之间的联系与天然EF-1α基因的调控是一致的，所述天然EF-1α基因被组成型表达以在核糖体蛋白复合物中发挥作用。EF-1α的表达已经被证明在转化的细胞(Sanders等，Nucleic AcidsResearch 20:5907；1992)和丝裂原刺激的细胞(Thomas和Thomas,Journal ofCellBiology 103:2137；1986)中增加，这与EF-1α在活跃生长细胞中的组成型表达是一致的。除了生长的细胞的转录控制，胰岛素生长因子通过mRNA 5'非翻译区(5'UTR)来调控EF-1α的翻译(Hammond和Bowman,Journal of Biological Chemistry 25:17785；1988；Proud和Denton,Biochemical Journal 328:329；1997)。通过在5'UTR中发现的多嘧啶系统(TOP)序列来实现这种翻译控制(Mariottini和Amaldi,Molecular and Cellular Biology 10:816；1990)。

CHEF1表达系统已经示出能够实现比采用其他常用启动子(例如，巨细胞病毒(CMV)、人EF-1α以及猿猴病毒40(SV40)启动子)的载体更高水平的蛋白表达(Running Deer和Allison,Biotechnology Progress 20:880；2004)。CMV启动子是用于重组蛋白表达最广泛使用的启动子之一。例如，谷氨酰胺合成酶(GS)系统使用鼠科或人CMV启动子(Kalwy,S.,Towards stronger gene expression-a promoter's tale,第19届欧洲动物细胞技术(ESACT)学院会议,2005)。商业表达质粒pcDNA^TM3(Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)携带来源于之前描述的主要立即早期(IE)基因(GenBank Accession#K03104.1)的CMV启动子(Boshart等，Cell 1985；4:521)。另一个常用的CMV启动子来源于人CMV株AD 169(GenBank Accession#X17403.1)，也称为人疱疹病毒5。