[发明专利]人分泌球蛋白的修饰和新型组合物

说明书

技术领域

本发明的领域涉及化学或酶修饰的合成的分泌球蛋白制剂，与未修饰版本相比具有改变或增强的性能。更具体地，利用活性氧物质(ROS)、活性氮物质(RNS)、酶催化修饰的重组人分泌球蛋白蛋白质的修饰，如髓过氧化物酶加的过氧化氢，或转谷氨酰胺酶催化修饰。本发明进一步涉及的修饰分泌球蛋白的新亚型的特性，修饰分泌球蛋白的优化工艺，及分泌球蛋白亚型的隔分离。本文中的术语“亚型”是指包含一个或多个化学修饰的氨基酸的一种分泌球蛋白或CC10单体、二聚体、或其它包含长度为至少60个氨基酸的完整单体的多聚体复合物。本发明还涉及生物活性的改变，结构构象的变化，或通过它的一个或多个氨基酸化学或酶修饰的分泌球蛋白的生物化学特性。本发明还涉及通过用ROS、RNS、和酶催化的氨基酸修饰的化学修饰增强rhCC10的抗病毒活性。本发明还涉及通过用ROS、RNS、和酶催化的氨基酸修饰的化学修饰增强抑制中性粒细胞的迁移。

发明背景

分泌球蛋白是包括四螺旋束单体以形成二硫化物二聚体、四聚体和更高的多聚体结构上相关蛋白质的一族。有8个已知的人分泌球蛋白(图1)及克拉拉细胞(ClaraCell)10kDa蛋白(CC10)，也被称为子宫珠蛋白、克拉拉细胞16kDa蛋白(CC16)、克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)、子宫球蛋白、尿蛋白-1，及分泌球蛋白1A1(SCGB1A1)，是这一族中最丰富的和众所周知的成员。分泌球蛋白和CC10被认为在所有脊椎动物存在。虽然这些蛋白质生理作用和具体机制，包括CC10尚不清楚，但是认为基于所知的CC10、分泌球蛋白在调节免疫反应中起作用。

哺乳动物分泌球蛋白的主要来源是肺和气管上皮细胞，尤其是无纤毛支气管气道上皮细胞(主要是克拉拉细胞)，及他们在成人肺的细胞外液中是非常丰富的局部产生的蛋白质。它们也在鼻腔上皮细胞中分泌。在血清和尿液中也存在呼吸分泌球蛋白，其在很大程度上是来自于肺源。CC10也由生殖组织(子宫、精囊)、外分泌腺(前列腺、乳腺、胰腺)、内分泌腺(甲状腺、垂体、肾上腺和卵巢)以及由胸腺和脾脏产生(Mukherjee,1999；Mukherjee,2007)。人CC10体内的主要是同型二聚体，由两个相同的70个氨基酸的单体组成，具有4.7-4.8的等电点。虽然它在SDSPAGE上以约10kDa的表观分子量迁移，但是其分子量为15.8kDa。单体以反向平行构型排列，具有与其它C-末端相邻的N-末端，及以完全氧化形式的二聚体，在Cys3单体和其它Cys69之间通过两个二硫键连接(Mukherjee,1999)。

修饰蛋白质上的氨基酸残在有许多化学和酶促方法。所述分泌球蛋白经受N-末端信号肽的裂解，这是在哺乳动物细胞中分泌过程的一个组成部分。但是不知道他们是被糖基化还是脂质化。然而，在炎症反应期间分泌球蛋白通过相同的过程在细胞外环境中影响所有其他蛋白质。天然CC10在体内进行化学修饰及在患者样本中已经确定的天然CC10的新亚型在来自正常人的样本中不存在(Lindhal,1999；Ramsay,2001；Ariaz-Martinez,2012)。假定修饰是由炎症过程导致的，因为新亚型只在来自患有特征在于持续的或急性炎症的呼吸病症患者的气道内膜液(ALF)的样本中被确定。尽管有些人推测，修饰CC10是与由炎症反应所产生的活性氧物质反应的结果，但是修饰的性质目前是未知的。此外，氧化修饰天然CC10被认为代表损坏蛋白质，其抗炎活性和免疫调节功能受损，从而促进患有呼吸窘迫的早产儿慢性肺病的发展(Ramsay,2001)。

合成CC10蛋白可通过重组或化学合成方法进行(Barnes,1996；Mantile,1993；Nicolas,2005)。CC10是结构相关的蛋白质统称分泌球蛋白的族中最知名的一个成员(Klug,2000)。八种人分泌球蛋白成熟分泌序列的氨基酸序列如图1中所示。N-末端是基于共识的信号肽切割位点的预测，并没有通过天然蛋白质的N-末端测序确认。所有分泌球蛋白共享一个保守的四螺旋束的二级结构，因此，一般认为介导相似的生理功能。