[发明专利]用于将基因递送到细胞的功能化DNA树状聚合物

说明书

技术领域

本发明涉及用于将基因递送到细胞并在所述细胞中表达所述基因的功能化DNA树状聚合物的领域。

背景

由于治疗性DNA的递送允许直接治疗受影响的细胞，故基因疗法是针对多种细胞异常、疾病和病症的一种颇具前景的治疗。理论上，将DNA靶向递送到期望的细胞，以及一旦DNA被细胞吸收即控制表达的能力应当提供使用常规疗法难以实现的改善水平的治疗效率和特异性。但实际上，DNA疗法的潜力尚未得到完全实现。一种挑战是用于将DNA递送到细胞的适当载体的选择。病毒载体会引起严重的副作用。因此，已经寻求非病毒载体。已经研究使用阳离子脂质体将基因转移到细胞中，但尚未得到令人满意的结果。

近来，通过使编码DNA与阳离子聚合物络合所形成的纳米粒子对于基因疗法已经显示前景，特别是当加入官能团来改善递送和治疗功效时(例如，用以改善细胞特异性和积聚的靶向部分，以及用以改善细胞吸收的膜渗透部分，及用于防止降解的特征)。这些官能团中有许多被认为是将治疗性生物试剂(包括基因)递送到细胞所必须的。不幸的是，其还增加基因治疗剂的复杂性和其生产成本。此外，DNA凝聚之后的分子量、大小、电荷以及端基封端的选择会对纳米粒子的转染潜力具有巨大并且无法预计的影响。另外，阳离子聚合物纳米粒子在与将另外改善其特异性的靶向部分偶联之后，通常会损失其DNA递送能力。然而，使用阳离子聚合物纳米粒子将DNA递送到细胞的一个优势在于其能够递送较大的DNA有效负载。

DNA树状聚合物是由互连的天然或合成核酸单体亚单位构建的复杂分支状分子。每个单体是由两条DNA链构成，这两条DNA链共用位于每条链的中心部分中的序列互补区。这两条链退火形成单体，从而产生了中心双链“腰(waist)”邻接四个单链“臂”的结构。在不同单体类型末端处的单链“臂”被设计成与互补单体类型的“臂”碱基配对。这允许从单一起始单体开始，将树状聚合物定向组装成一系列逐步单体层。树状聚合物的一个有用特征是，最后一层单体的添加在分子的表面上留下未配对的单链“臂”。表面层单链“臂”的数量随层数而增加。在表面上的单链“臂”可用于附接多个分子以为树状聚合物提供官能团，包括对特定应用特异的标记或分子。功能分子可以直接偶联到树状聚合物臂，或经由与树状聚合物臂杂交进行附接。由于可用的单链“臂”具有多样性，故可以将多种不同的官能团附接到树状聚合物，例如靶向部分和标记。已经认识到，树状聚合物可以在多种测定中提供增强的检测特异性和灵敏度。

特定细胞中白喉毒素(DT)基因的靶向表达会导致这些细胞死亡。白喉毒素是选择用于细胞消融的毒素之一，因为其作用机制是众所周知的，并且这种基因已经被克隆，测序并适用于在哺乳动物细胞中表达。由白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)分泌的前体多肽随后经酶促裂解成A链和B链片段。B链与真核细胞的表面结合并且将A链递送到细胞质中。DT-A抑制细胞内的蛋白质合成并且具有极高毒性；单一分子就足以杀死细胞。已经在用于驱动表达的细胞特异性、顺式作用转录调控元件的控制下，独立于DT-B亚单位克隆出DT-A亚单位的编码序列。在DT-A亚单位杀死细胞之后，其可以从死亡的细胞释放；然而，DT-A不能进入相邻细胞。

因此，需要将可表达的基因靶向递送到细胞的组合物和方法，这些组合物和方法是可预测的，具有特异性并且在内化这些基因的众多细胞中提供显著功效。本发明解决这些要求。

发明概要

在第一方面，本发明涉及包含连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物的组合物，所述DNA序列包含编码多肽或调控RNA的DNA序列，所述DNA序列与调控所述编码多肽或调控RNA的DNA序列的表达以产生编码所述多肽的RNA或产生所述调控RNA的DNA序列连接。此类DNA树状聚合物在本文中称为“功能化”DNA树状聚合物。

在连接有一个或多个DNA序列的DNA树状聚合物的具体实施方案中，调控表达的DNA序列包括启动子。