[发明专利]用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法

说明书

本发明涉及以高产率生产腐胺的重组微生物和使用该微生物生产腐胺的方法，其中在微生物中NCgl2522活性增加，所述微生物以使得腐胺生产是可能的方式被修饰。

背景技术

1.发明领域

本发明涉及具有改进的腐胺生产力的重组微生物和使用其以高产率生产腐胺的方法。

2.相关技术的描述

多胺比如亚精胺、精胺等等存在于大多数活细胞中，并且腐胺(或1,4-丁二胺)用作亚精胺和精胺代谢中的前体。腐胺在革兰氏阴性菌或真菌中发现，并且其在各种物种中以高浓度存在，这表明其在微生物的代谢途径中具有重要作用。

一般而言，腐胺是聚胺尼龙-4、6——其通过与己二酸反应产生——合成中的重要原料。腐胺主要通过自丙烯通过丙烯腈和琥珀腈的化学合成产生。该化学合成是三步法，其包括催化氧化反应、使用氰化物化合物的反应和使用高压氢的加氢反应。因为该化学合成不是环境友好的并且也消耗大量的能量，导致石油耗竭，所以存在问题。因此，需要开发涉及生物质利用的更环境友好的和能量有效的方法用于腐胺生产。

在微生物体内，腐胺的生物合成途径与从谷氨酸到鸟氨酸合成的精氨酸合成路线相同。腐胺可以自微生物通过两条途径生物合成。在一条途径中，作为中间体的鸟氨酸脱羧基以合成腐胺。在另一条途径中，通过自鸟氨酸合成的精氨酸脱羧反应产生胍基丁胺，然后自胍基丁胺合成腐胺(Morris等，J Biol.Chem.241:13,3129-3135,1996)。这两条途径产生代谢所需要的能量或者使细胞具有对氧化应激的抗性。

作为使用微生物生产腐胺的方法，通过转化大肠杆菌和棒状杆菌以高浓度生产腐胺的方法已经被报道(国际专利公开号WO06/005603；国际专利公开号WO09/125924；QianZD等，Biotechnol.Bioeng.104:4,651-662,2009；Schneider等，Appl.Microbiol.Biotechnol.88:4,859-868,2010；Schneider等，Appl.Microbiol.Biotechnol.91:17-30,2011)。例如，WO09/125924公开了通过增强鸟氨酸生物合成途径而不是失活参与在大肠杆菌中存在的腐胺的降解和利用的途径和失活作为腐胺的前体的鸟氨酸到精氨酸的转化，来以高产率生产腐胺的方法。此外，Schneider(2010)公开了通过将能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质引入不具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种菌株和增强能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质进入不具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种菌株，以高浓度生产腐胺的方法。

而且，对在大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞中腐胺运载体的研究已经积极地进行(K Igarashi，Plant Physiol.Biochem.48:506-512,2010)。大肠杆菌的腐胺摄取经由4种途径发生；由ATP水解作用驱动的potABCD或potFGHI，和作为H+同向转运体(symporter)的potE和puu途径的puuP。关于参与腐胺摄取的这些复合体的Km值，PotFGHI、potABCD、potE和puuP的Km值分别为0.5mM、1.5mM、1.8mM和3.7mM。在这四种腐胺摄取途径中，potFGHI复合体被认为是最合适的。此外，potE运载体具有摄取和分泌腐胺二者的功能。腐胺在中性pH下与质子一起被输入细胞中。然而，由于腐胺合酶(speF)在酸性pH条件下表达，所以细胞外鸟氨酸的细胞内摄取和在细胞内合成的腐胺的细胞外分泌同时发生(Kurihara等，J.Bacteriology 191:8,2776-2782,2009)。

酵母中已知的腐胺输出蛋白(exporter)是TPO1和TPO4。这些氨基酸序列与芽孢杆菌多药运载体Blt的氨基酸序列非常相似。