[发明专利]用于测定维生素D代谢物的方法和试剂

说明书

技术领域

本发明涉及用于释放结合性维生素D的方法，这是通过使得含维生素D的试样与释放剂接触的方式实现的，这种释放剂包含至少一种助水溶性物质和至少一种过渡金属盐。所述被释放的维生素D可接着被定量地测定。另外，本发明还涉及用于释放和任选的测定维生素D的试剂，包含至少一种助水溶性物质和至少一种过渡金属盐，以及涉及这种用于释放和任选的测定维生素D的释放剂的应用。

背景技术

对于人而言，提供充足的维生素D非常重要。维生素D的最常见生理形态是维生素D3或维生素D2。维生素D3(Cholecalciferol)最重要的、具有生理效应的衍生物是25OHD3(25-羟基维生素D3或骨化二醇)和1，25(OH)₂D3(1-alpha，25-二羟基维生素D3或骨化三醇)。通常，绝大多数的维生素D3并不像其他维生素那样是通过食物被吸收的，而是在UV光线的作用下在皮肤内生成的。其中，7-二羟基胆固醇通过UV照射被转换为预维生素D3，其中不稳定的中间产物会重组构成维生素D3。在食物中，维生素D3尤其是包含在脂肪丰富的鱼类中。维生素D的能够出现在人体中的另一种形态是维生素D2(钙化醇或麦角钙化醇)，其可出现在菌类中并且连同食物一起被吸收。维生素D3和维生素D2制剂则构成用于提供充足维生素D量的另一种来源。

维生素D及其天然的衍生物是非常疏水的分子。在血液中，维生素D输送是在与维生素D-结合-蛋白质(DBP)的复合物中实现的。DBP属于清蛋白族并且结合维生素D、维生素D代谢产物和脂肪酸。

在肝脏中，维生素D通过细胞色素P450在C-25位被氧化。所得25OHD(25-羟基维生素D3或25-羟基维生素D2)是主要存在于循环中的维生素D代谢物。血清中的25OHD浓度充当评价人体的维生素D状态的指标。

在肾脏和其他器官内，25OHD就转化为1，25(OH)₂D即维生素D的生理活性形态，其在与维生素D受体(VDR)结合后调节依赖维生素D所调控(VDRE)的基因活性。

提供充足的维生素D，对于正常的骨结构以及对于要调控钙和磷酸盐再吸收而言，非常重要。借助1，25(OH)₂D来活化受体，就将肠的钙吸收率提高了约30％以及将磷酸盐吸收率提高了约80％。当血清中25OHD的浓度下降到30ng/ml以下时，则其与肠内钙再吸收的明显减少以及甲状旁腺素浓度的上升有关。维生素D缺乏作为高骨折风险的骨质疏松的重要因素，关联于其他健康风险。由于血清中的维生素D浓度水平取决于食物吸收和日照而剧烈波动，25OHD血清浓度则充当用于确定维生素D供给状态的良好指标。因此，在医疗诊断中常规地进行血清25OHD浓度的测定。

25OHD和其他维生素D物质在DBP上的结合构成维生素D代谢物测定的重大障碍。所有测定方案都要以从DBP复合物中释放出维生素D代谢物作为前提。

为了能够测定血清中的维生素D及其代谢物，其必须将其从与DBP的结合中释放出来。这可通过不同的方法来进行，例如借助有机溶剂(例如乙醇、甲醇)析出DBP或者借助成相(phasenbildenden)溶剂例如氯仿或己烷由水相提取维生素D及其代谢物。

US7,482,162B2(ImmunodiagnosticSystemsLtd.)说明了使用8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐(8-ANS)作为非竞争性抑制剂，用于释放与DBP结合的1，25(OH)₂D。

WO2011/144661(RocheDiagnosticGmbH)说明了一种试剂混合物，其包含释放出碳酸盐或碳酸氢盐的物质和与之结合的还原剂和碱化物质，其中维生素D代谢物从DBP复合物的释放是在11至14的pH范围内进行的。

EP2126586(ImmundiagnostikAG)涉及借助蛋白酶K的蛋白水解法来使得DBP失活、由此引起维生素D代谢物释放并且随后在ELISA试验系统中测定维生素D代谢物的应用。

US7,087,395(Quest)涉及从DBP释放维生素D代谢物的方法：在pH13用碱性试剂混合物预处理血清，所述碱性试剂混合物由NaOH、洗涤剂、环糊精衍生物和水杨酸盐所组成。

WO2008/138783(NordicBiosciencesA/S)说明一种血清或血浆样品的预处理，其借助了双羟萘酸来从DBP复合物释放维生素D。

然而，目前所已知的用于从与DBP的复合物释放维生素D的方法要么投入巨大并且难以自动化，要么容易出现误差。