[发明专利]用于检测蛋白质和核酸的纳米孔生物传感器

说明书

本文涉及基于修饰的溶细胞素蛋白质的纳米孔生物传感器。所述纳米孔生物传感器容纳包括蛋白质和核酸的大分子，并且可以额外地包括具有选择性结合性质的配体。

技术领域

本发明涉及基于修饰的溶细胞素蛋白质的纳米孔生物传感器。所述纳米孔生物传感器容纳大分子，所述大分子包括折叠的蛋白质和核酸，所述核酸包括双链(ds)DNA，所述纳米孔生物传感器与其他纳米孔生物传感器相比，显示出增强的活性，溶解性和电性质。

背景技术

离子或分子穿过生物膜的运输是细胞生命的基本过程，且所述运输被离子通道，转运蛋白(transporter)和孔紧密地调节。最近，研究者在单分子分析中采用生物的，¹固态的，²DNA折纸³和混合的^3a,b,4纳米孔。⁵生物纳米孔与它们的合成对应物相比具有优势，主要是因为它们可以重复制造并以人工纳米孔无法匹敌的原子水平精度修饰。然而，生物纳米孔仍有缺点。生物纳米孔的机械稳定性取决于具体情况。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的α溶血素(αHL)纳米孔和来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的孔蛋白A(MspA)纳米孔在脂类双分子层中在高施加电势下保持打开，而且令人惊讶的是能很好地对抗温度，⁶pH^6b,7和变性剂浓度的极端条件。^6b,8然而，多数其他孔蛋白和通道不太牢固。然而，可认为地，生物纳米孔最大的不利条件是其固定的尺寸。例如，αHL，MspA或气单胞菌溶素纳米孔的尺寸允许对单链核酸、适配子或小肽进行分析，⁹但是它们较小的内直径(～1nm)妨碍了对其他重要生物系统例如折叠的酶或核酶的直接研究。

最近大量的研究对折叠蛋白质迁移穿过人工纳米孔进行了采样。¹⁰然而，对具有固态纳米孔的蛋白质的研究是困难的，因为蛋白质具有不均匀的电荷分布，它们经常吸附到纳米孔表面而且它们太快迁移而不能合适地取样。^10c进一步地，由于蛋白质具有紧密折叠结构，纳米孔的直径应该与蛋白质的直径相似。^10b最近，我们已经介绍了作为第一生物纳米孔的来自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的溶细胞素A(ClyA)，其能够对天然折叠蛋白质进行研究。^7a ClyA结构对于这项任务是理想的，因为蛋白质例如凝血酶(37kDa)或苹果酸脱氢酶(二聚体，35kDa单体)可在宽的顺式入口(5.5nm，表1)和窄的反式出口(3.3nm，表1)之间被电泳捕获，并可因此采样若干分钟。因为离子电流穿过ClyA对于前庭环境非常敏感，因此人和牛的凝血酶的阻断可以非常容易被识别。^7a我们的工作是基于ClyA结构，所述ClyA结构中，ClyA-WT(C87和C285)的两个天然半胱氨酸残基被丝氨酸(ClyA-SS)取代。^7a然而，当与ClyA-WT单体相比时，ClyA-SS单体显示低的水溶解性和低活性(图S1)，且在施加的电势高于+60mV或低于-90mV时，ClyA-SS单体在平面脂类双分子层中自发地打开和关闭(门控(gated))。

因此，现有技术中仍需要具有对目标分析物的高灵敏度和在电势范围内具有高水溶性和稳定性的纳米孔生物传感器。所述纳米孔生物传感器应具有良好的寡聚性、电压依赖型门控性和在单通道电流记录中的电噪音性能。本发明涉及工程纳米孔，与ClyA-WT和ClyA-SS相比，在所述纳米孔中对天然半胱氨酸残基和其他残基的特定取代赋予了其额外的性质。

发明内容