[发明专利]真核生物中的靶向基因组工程

说明书

发明领域

本发明涉及农学领域。更具体地，本发明提供在真核细胞，例如植物细胞的基因组中的精确定位的核苷酸序列处引入靶向修饰的方法和手段，该靶向修饰包括插入、缺失或取代。该修饰通过在第一步中使用双链DNA断裂诱导酶例如TALEN在识别核苷酸序列处诱导双链断裂而触发，随后使用修复核酸分子作为模板通过同源重组在断裂位点或靠近断裂位点的位置引入基因组修饰。当设计修复DNA的序列，使其介导同源重组以在断裂和识别位点外实现靶向插入时，相比于精确地在断裂位点处的插入，靶向插入事件的频率增加。

背景技术

在基因组例如植物基因组中引入靶向修饰，包括控制外源DNA的整合位置，已经成为日益重要的需要，并且已经尝试开发了几种方法以满足该需要(综述参见KumarandFladung,2001,TrendsinPlantScience,6,pp155-159)。这些方法大多数依赖于，最初通过表达双链断裂诱导(DSBI)酶在靶向位置引入双链DNA断裂。

通过切点罕见核酸内切酶，例如I-SceI，诱导双链DNA断裂(DSB)以激活靶位点和/或修复或供体DNA，已经被证实可以使同源重组频率增加几个数量级。(Puchtaetal.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93,pp5055-5060；ChiltonandQue,PlantPhysiol.,2003；D’Halluinetal.2008PlantBiotechnol.J.6,93-102)。

WO2005/049842描述，使用切点罕见“双链断裂”诱导(DSBI)酶、以及改进的I-SceI编码核苷酸序列、在植物中改进靶向DNA插入的方法和手段。

WO2006/105946描述，用于在植物细胞和植物中使靶DNA序列与目的DNA序列通过同源重组精确交换的方法，其中，使用该文献中描述的通过小孢子特异性表达DSBI切点罕见核酸内切酶而除去选定DNA的方法，可以将在该同源重组阶段用于暂时选择基因置换事件的可选择或可筛选标记随后除去而不留下足迹，而且在该除去步骤中不依赖体外培养。

WO2008/037436描述WO2006/105946的方法和手段的变体，其中由双链断裂诱导性切点罕见核酸内切酶诱导的选定DNA片段去除步骤，在种系特异性启动子控制下进行。该方法的其它实施方案依赖于在修复DNA的一端的非同源性末端接合和在另一端的同源重组。WO08/148559描述WO2008/037436的方法的变体，即，用于在真核细胞例如植物细胞中使靶DNA序列与目的DNA序列通过同源重组精确交换的方法，其中，通过去除侧翼具有同向重复的二核苷酸序列的选定DNA的方法，将在该同源重组阶段用于暂时选择基因置换事件的可选择或可筛选标记随后除去而不留下足迹。

此外，已经描述允许设计切点罕见核酸内切酶以改变该酶的底物或序列特异性的方法，由此允许在目的座位诱导双链断裂而不依赖于存在任何天然切点罕见核酸内切酶的识别位点。简言之，可以使用杂合体制备嵌合限制性酶，该杂合体是在设计用于识别特异核苷酸序列的锌指结构域和来自天然限制性酶(例如FokI)的非特异性DNA-切割结构域之间的杂合体。这些方法已经描述在例如WO03/080809,WO94/18313或WO95/09233中以及Isalanetal.,2001,NatureBiotechnology19,656-660；Liuetal.1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94,5525-5530中。通过从变体文库中进行选择来产生定制的大范围核酸酶的另一方法，描述于WO2004/067736中。具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的定制大范围核酸酶或重新设计的大范围核酸酶也可以通过描述于WO2007/047859中的合理设计来获得。此外，WO10/079430和WO11/072246描述了，具有可定制的DNA结合特异性的转录激活物样效应物(TALEs)蛋白的设计、以及如何能够将这些蛋白与核酸酶结构域(例如FOKI)融合以产生具有针对基本上任何DNA序列的序列特异性的嵌合限制性酶，即TALE核酸酶(TALENs)。

Bedelletal.,2012(Nature491:p114-118)和Chenetal.,2011(NatureMethods8:p753-755)描述了，分别使用TALENs或ZFNs在哺乳动物细胞中由寡聚物介导的基因组编辑。