[发明专利]高度选择性核酸扩增引物

权利要求书

1.一种试剂盒，其包含用于检测方法中的试剂，其中所述方法包括具有多个循环的引物退火和引物延伸的引物依赖的扩增反应并能够在含有每个突变体靶序列的100,000个拷贝的密切相关的野生型DNA靶序列的混合物中检测少至10拷贝的至少一个稀有的突变体DNA靶序列，所述试剂包括至少一种DNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTP、至少一种用于检测扩增的一个或多个产物的检测试剂，以及针对每个突变体靶序列的包括多部分引物的引物对，所述多部分引物以5'-3'方向包含以下三个连续的DNA序列：

锚定序列，其在引物退火过程中与突变体靶序列和与其密切相关的野生型靶序列杂交；

桥序列，其在引物退火过程中不与突变体靶序列或其密切相关的野生型靶序列任一个互补；以及

足序列，其长5-8个核苷酸并与突变体序列完全互补且与其野生型序列错配一个或两个核苷酸，其中

i)如果引物的锚定序列和足序列与突变体靶序列或与其密切相关的野生型靶序列杂交，则在靶序列中有不与引物的桥序列在引物退火过程中杂交的插入序列，并且桥序列和插入序列一起形成杂交体中的泡，所述泡具有28-52个核苷酸的周长，其中插入序列至少长8个核苷酸且桥序列的长度等于或大于插入序列的长度，

ii)泡的周长和足序列的长度组合起来导致弱的足序列/突变体靶序列杂交体，该杂交体使得突变体靶序列的拷贝变得不太可能，

iii)桥序列和足序列未一起引发混合物中的非靶序列，且

iv)在所述循环过程中，多部分引物/野生型靶序列杂交体将被延伸的概率至多为在所述循环的过程中多部分引物/突变体靶序列杂交体将被延伸的概率的1/10,000，这得到了至少13.3个循环的ΔC_T的证实，

其中至少一种检测试剂是双链DNA结合染料，所述染料要么是针对每一个多部分引物的荧光杂交探针，其在杂交到引物的扩增产物时发出信号，要么是针对每一个多部分引物的淬灭的、荧光标记的引物5'末端的寡核苷酸发卡，其仅在掺入或杂交到引物的扩增产物时才发出荧光，以及

其中拷贝变得不太可能是指，如果扩增反应以含有10⁶拷贝的至少一个突变体DNA靶序列、无野生型序列、DNA聚合物、扩增缓冲液、dNTP、至少一种检测试剂和多部分引物的反应混合物，且分别地以含有10⁶拷贝的至少一个突变体DNA靶序列、无野生型序列、DNA聚合物、扩增缓冲液、dNTP、至少一种检测试剂和常规引物替换多部分引物的反应混合物开始，利用多部分引物的扩增反应的循环阈值与利用常规引物的扩增反应的循环阈值相比，延迟至少5个循环。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中每一个多部分引物的足序列在引物的3'核苷酸和3'倒数第二个核苷酸之一或二者处与其野生型靶错配。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中检测方法具有下述特征的一个或多个：

至少一个突变体靶序列为cDNA，并且

扩增反应为聚合酶链式反应。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中对于至少一个多部分引物的每一个，以10⁶拷贝的突变体DNA靶序列和多部分引物开始的反应与以10⁶拷贝的突变体DNA靶序列和常规引物开始的反应相比，循环阈值延迟是至少10个循环。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中在每一个引物对中多部分引物都是过量的引物。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其中至少一个突变体靶序列是一个突变体靶序列。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其具有下述特征的一个或多个：

针对突变体靶序列的多部分引物具有长6-7个核苷酸的足序列，且

泡周长为28-44个核苷酸长。