[发明专利]在大肠杆菌的细胞质和/或培养基中表达真人类表皮生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子的手段和方法

说明书

本发明涉及一种生物工程系统，特别是大肠杆菌宿主。所述宿主整合有DNA构建体组合用来生产至少第一多肽。第一多肽可以是真碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。DNA构建体中有插入片段，该插入片段包括，例如，按顺序，表达盒、内含肽和编码第一多肽的DNA。所述DNA构建体被配置为影响宿主胞内分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在宿主的细胞质中和/或外排到培养宿主的细胞培养基中。

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年4月3日提交的美国专利申请No.61/808,062的优先权，其公开的内容通过全部援引的方式合并于本申请中。

序列表

如上即时申请包括序列表，通过全部援引的方式合并于此。

技术领域

本申请涉及在大肠杆菌(Escherichia coli)的细胞质和/或培养基中表达真(authentic)人类表皮生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子的手段和方法。

背景技术

虽然大肠杆菌不能进行翻译后修饰，但大肠杆菌仍然是用来生产重组人类治疗性蛋白最常用的宿主系统。在这些蛋白中，包括表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在内的皮肤蛋白不需要翻译后修饰，例如维持生物活性和稳定性的糖基化修饰，这些皮肤蛋白已经使用多种策略在大肠杆菌中得到了表达。

可能是由于尺寸小，EGF已经在大肠杆菌中得到了高效表达、分泌甚至外排(excrete)到培养基中。外排的EGF不仅被证实是有生物活性的，更重要的是，其还显示出具有正确的初级(真)结构。此外，由于通过外排生产EGF不需要破坏细胞，所以外排生产的EGF可以免于内毒素的污染。另外，培养基中低水平的细胞质蛋白极大促进了EGF的纯化以达到高同质性。重要的是，这个过程高度可重复并易于扩展。

对于bFGF，尽管它具有分泌性，但是它并没有通过分泌或外排在大肠杆菌中获得成功表达。传统地，bFGF在大肠杆菌中的表达通过使用融合的方式已被局限于细胞质，在这种方式中，bFGF的回收依靠细胞的裂解、融合中间体的蛋白水解消化和通常通过亲和层析进行的后续纯化。bFGF的细胞内表达会导致高的生产成本，因为它要么需要昂贵的蛋白酶以切割融合产物，要么在内含物聚合体(inclusion aggregates)形成时需要劳动密集型的方案来再生bFGF。尽管有这些操作，但是bFGF在大肠杆菌中的表达仍没有圆满完成，因为生产的产物被证实未被正确加工或者没有生物活性。

之前已经尝试使用其它的重组系统来生产bFGF。其中一种尝试是关于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程来促进bFGF的分泌生产。通过使用能够精准的对融合前体进行肽酶加工的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)蛋白酶基因的NPR信号肽，并结合一种温和的破坏细胞壁稳定性的方案，具备真正结构和完全的生物活性的bFGF被证实分泌到了枯草芽孢杆菌的培养基中。

本发明提供了一种可替代的和/或改进的方法和系统，以用于可靠且高效地生产bFGF和/或其它有用的多肽。

发明内容

根据本申请的第一方面，提供了一种DNA构建体，以用于在大肠杆菌中生产至少第一多肽，其中，所述第一多肽是真碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，其中，所述DNA构建体中包括插入片段，所述插入片段按顺序包括表达盒、内含肽序列和编码碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DNA，其中，所述DNA构建体被配置成能够使宿主分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在宿主的细胞质中和/或外排到培养宿主的细胞培养基中。

优选地，所述DNA可以包含编码第二多肽的DNA，其中，编码第二多肽的DNA可以被安排在表达盒和内含肽序列之间。编码第二多肽的DNA以可以编码真人类表皮生长因子(EGF)。所述DNA构建体可以被配置成能够使宿主以非融合多肽的形式分泌第一和/或第二多肽。