[发明专利]单核苷酸检测方法

说明书

本发明涉及用于表征RNA或DNA的方法，所述方法是通过检测通过逐步降解由所述RNA或DNA产生的单核苷酸碱基的有序序列。

遗传物质的下一代测序已经对总体生物学和医学产生巨大的影响，尤其是因为测序的单位成本随着越来越快的测序仪进入市场而直线下降。因此，在一种这样的机器中，首先将双链DNA分析物分解为多个更小的多核苷酸片段，各个多核苷酸片段首先在一条链的两端被腺苷酸化(adenylate)，使得单链第一寡核苷酸可以通过与未配对的腺嘌呤碱基杂交结合于其互补体(compliment)的两端。然后将这样获得的处理的片段按大小进行选择并捕获到用结合的单链第二寡核苷酸包被的表面上，所述单链第二寡核苷酸自身是第一个的序列互补体，使得实质上，通过进一步杂交可以形成表面结合的双链片段的文库。在随后的聚类(clustering)步骤中，随后使用延伸和等温桥接反应将这些文库组分在表面上克隆扩增数百万次，以利用未使用的第二寡核苷酸。这实质上产生了通过其一条链结合于表面的稠密浓度的多核苷酸片段。然后除去各个片段的未结合的互补链，从而留下结合的单链片段供测序使用。在测序阶段，用引物引发(prime)这些单链片段中的每个并且通过使用聚合酶链反应和双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)形式的DNA的四种特征核苷酸碱基的混合物进行延伸来再产生其互补链。各个ddNTP类型用在不同波长发荧光的不同荧光团标记的部分封端。然后延伸反应采用三步骤的循环形式；首先相关ddNTP结合于生长的链；接下来通过照射样品并检测荧光的波长来鉴定其包含的核苷酸碱基，并且最后除去封端及其相关荧光团从而允许接下来的延伸事件发生。通过这种方式，互补链的序列可以逐个碱基地建立。将理解的是，虽然这种方法可以是高度自动化的并且可以产生高准确度的序列读取，但其运行速度受延伸循环速率的限制。因此，在实践中，该技术的使用倾向于包括平行处理相对短的多核苷酸片段和自由其获得的各种读取结果(reads)组装整个序列。这本身可能导致计算的复杂度并且可能引入错误。

最近已经进行尝试开发直接测序方法。例如，WO2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中尤其是，单链或双链多核苷酸样品(例如天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其经由设置有并置在纳米孔(nanopores)的出口内或附近的等离子体纳米结构(plasmonicnanostructures)的纳米穿孔基板转移来读取。在该装置中，所述等离子体纳米结构限定检测窗(实质上是电磁场)，在所述检测窗内，通过与入射光相互作用，各核苷酸碱基(优选标记的)又被诱导从而以特征方式发荧光或拉曼散射光子。随后远程检测这样产生的光子，多倍化(multiplexed)并转化为数据流，其信息内容表征为与多核苷酸相关的核苷酸碱基序列。然后可以使用被嵌入在被编写入与其集成的微处理器或与其连接的辅助计算装置中的相应软件中的计算算法将该序列由所述数据流复原。关于使用等离子体纳米结构和其相关共振特征的进一步背景可以在例如Adv.Mat.2004，16(19)pp.1685-1706中找到。

另一种快速测序多核苷酸的装置在例如，US6627067，US6267872和US6746594中描述。在其最简单的形式中，该装置使用电极替代等离子体纳米结构，来限定跨过基板或在纳米孔出口中或纳米孔出口周围的检测窗。随后应用跨电极的电位差，并且测量作为多核苷酸和相关电解质经由纳米孔的电泳转移的结果的电极之间流动的离子介质的电学特性的改变，作为时间的函数。在该装置中，因为多种个体核苷酸碱基通过检测窗，它们连续阻塞和开启检测窗，引起导致电流或电阻率的特征性波动的‘事件’。然后这些波动用于产生合适的数据流用于上述分析。

稳定小滴流(dropletstream)，特别是微滴流(microdropletstream)的产生，已经应用于分子生物学的技术的另一开发领域。例如，US7708949公开一种用于在油中产生稳定的水滴的新型微流体方法，同时例如US2011/0250597描述了使用该技术产生含有核酸模板(通常是多核苷酸DNA或RNA片段)和使得能够使用聚合酶链反应扩增所述模板的多个引物对的微滴。其他与该领域相关的专利申请通常包括JP2004/290977，JP2004/351417，US2012/0122714，US2011/0000560，US2010/01376163，US2010/0022414和US2008/0003142。