[发明专利]大鼠的遗传修饰

权利要求书

1.一种体外培养物，其包含：

(a)饲养细胞层，所述饲养细胞层未被修饰成表达白血病抑制因子(LIF)；

(b)培养基，所述培养基包含50U/mL至150U/mL的LIF及由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成的抑制剂组合，其中所述培养基不包含ESRF；以及

(c)大鼠胚胎干(ES)细胞群，其中所述大鼠ES细胞：

(i)被修饰以包含靶向遗传修饰，所述靶向遗传修饰包括所述大鼠ES细胞的基因组中异源多核苷酸的至少一个插入，并且能够通过生殖系传递所述靶向遗传修饰；

(ii)缺乏c-Myc的表达；

(iii)具有正常的核型；

(iv)在培养物中形成球状、自由漂浮的集落。

2.如权利要求1所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞源自于ACI大鼠或DarkAgouti(DA)大鼠。

3.如权利要求1所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞能够在一轮或多轮电穿孔之后，将所述靶向遗传修饰传递到子代中。

4.如权利要求2所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞能够在一轮或多轮电穿孔之后，将所述靶向遗传修饰传递到子代中。

5.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述靶向遗传修饰包括缺失、敲除、敲入、点突变或其组合。

6.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞包含两个或更多个靶向遗传修饰并且所述大鼠ES细胞能够通过生殖系传递所述两个或更多个靶向遗传修饰。

7.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述异源多核苷酸包含选择标记,所述选择标记物具有一个或多个以下特征：

(a)所述选择标记物包含可操作地连接到启动子的不衰减的选择标记物基因；

(b)所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性；和

(c)所述大鼠ES细胞包含稳定整合入基因组中的多个拷贝的所述选择标记物。

8.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞是雄性(XY)大鼠ES细胞。

9.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞是雌性(XX)大鼠ES细胞。

10.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞可以在所述培养基中传代多达至少11次，而不降低所述靶向遗传修饰在所述大鼠ES细胞中的靶向效率或生殖系传递效率。