[发明专利]用于基于纳米结构的核酸测序的方法和组合物

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求对2013年2月20日提交的美国申请流水号61/766,925的权益。

发明领域

本公开一般涉及核酸测序系统和方法以及可用于这类系统和方法中的组合物。

发明背景

纳米结构DNA测序是一种DNA测序方法，能产生性价比高的、长读段和准确的全人基因组测序和有效的细菌基因组测序以及其他测序应用。本公开提供对现有纳米结构测序技术的大量改进并解决限制基于纳米结构的测序方法在例如临床应用和高通量环境中使用的许多限制。

发明概述

基于纳米结构的测序依赖于相对于纳米结构附近的固体表面固定化的聚合酶。作为通过聚合酶的碱基掺入和延伸的结果，核酸在酶聚合酶内移位(translocate)，并因此经过纳米结构、在纳米结构上面或纳米结构上方通过(through,on,oroverthenanostructure)。作为酶依赖性移位的结果，观察到跨越纳米结构的电信号中的变化。本文中描述的测序方法涵盖两个办法。第一个办法是逐个碱基测序，其中已知的碱基添加导致单碱基聚合和经过纳米结构、在纳米结构上面或通过纳米结构上方移位(即移动)。在第二个办法中，存在所有4种核苷酸，其中一种核苷酸以速率限制量存在。在4种核苷酸的3种核苷酸通过聚合酶掺入和随后延伸期间，核酸经过纳米结构、在纳米结构上面或通过纳米结构上方的移动以酶的正常速率进行。然而，在核酸内对应于速率限制性核苷酸的位置处，延伸/移位和因而经过纳米结构、在纳米结构上面或通过纳米结构上方的移动减速或中止。与速率限制性浓度的每种核苷酸的重复反应允许从生物信息学上组装完整的测序。

在一个方面，提供测定靶核酸分子的序列的方法。这类方法典型地包括在测序条件下使聚合酶与靶核酸分子接触，其中测序条件包括至少一种核苷三磷酸的存在，其中所述聚合酶固定化于固体基片上；检测所述靶核酸分子和/或一个或多个新生链经过纳米结构、在纳米结构上面或通过纳米结构上方的移动；将所述接触和检测步骤重复多次；并在所述至少一种核苷三磷酸存在的情况下，序贯地基于移动中变化的存在或缺乏来测定所述靶核酸分子的序列。在一些实施方案中，测序条件包括单一核苷三磷酸的存在。在一些实施方案中，测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸中的第一种核苷三磷酸以速率限制量存在。

代表性的固体基片是玻璃。在一个实施方案中，所述聚合酶是RNA聚合酶。代表性的RNA聚合酶包括，例如噬菌体RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶和T3RNA聚合酶)和细菌RNA聚合酶(例如大肠杆菌RNA聚合酶)。在一个实施方案中，所述聚合酶是DNA聚合酶。代表性DNA聚合酶包括，例如phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶经由His标签或经由一个或多个生物素-链霉亲合素键固定化于固体表面上。

在一些实施方案中，所述靶核酸分子是真核生物的。所述靶核酸分子可以是双链或单链的。在一些实施方案中，所述靶核酸分子包含在生物学样品中或作为其一部分。在一些实施方案中，所述靶核酸分子包含聚合酶启动子序列。在一些实施方案中，所述靶核酸分子还包含磁性标签。

代表性纳米结构包括，例如生物纳米结构、固态纳米结构或其组合。在一些实施方案中，检测步骤包括测量经过纳米结构、在纳米结构上面或通过纳米结构上方的电流中的变化和/或测量纳米结构的离子导电中的变化。检测步骤还可以包括捕获基于CMOS的制备的纳米结构和电子设备(electronics)上的移动。在一些实施方案中，所述方法还包括对所述靶核酸分子应用定向力。在一些实施方案中，用磁体产生所述定向力。在一些实施方案中，用流或压力产生所述定向力。