[发明专利]D‑阿洛酮糖3‑表异构酶突变体、重组载体和微生物、生产D‑阿洛酮糖的方法和反应器

说明书

技术领域

本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体；一种重组载体，其包含编码所述突变体的基因；以及一种微生物，其包含所述突变体。此外，本发明涉及一种使用所述酶突变体或所述微生物来制备D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-psicose)是一种已知为稀有糖(rare sugar)的单糖，因为其很少见于天然材料中或少量存在。D-阿洛酮糖具有超低能量和类似于糖的甜味，并且因此广泛用作功能性甜味剂。

D-阿洛酮糖是D-果糖(D-fructose)的差向异构体，并且具有极类似于D-果糖的甜度和味道。不同于D-果糖，D-阿洛酮糖几乎不在体内代谢，并且具有几乎零卡路里。D-阿洛酮糖可以用作减肥食品的高效成分，因为D-阿洛酮糖能够抑制参与脂质合成的酶的活性并且减少腹部肥胖。此外，广泛用作糖替代物的如木糖醇等的糖醇当大量食用时可能具有副作用，如造成腹泻。相反，D-阿洛酮糖已知实质上不具有副作用。

出于这种原因，D-阿洛酮糖吸引了作为节食甜味剂的高度关注，并且在食品工业中日益需要一种高效生产D-阿洛酮糖的方法。因此，随着开发D-阿洛酮糖的需要增加，已经作出各种尝试，以便使用现有生物方法从D-果糖生产D-阿洛酮糖。作为能够将D-果糖转化成D-阿洛酮糖的酶，已知衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖3-表异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPE)和衍生自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)或类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的塔格糖表异构酶。已知D-阿洛酮糖3-表异构酶具有比塔格糖表异构酶更高的活性。

在生产D-阿洛酮糖时，随着反应温度升高，生产更多D-阿洛酮糖。然而，在野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶用于生产D-阿洛酮糖的情况下，酶在约50℃或更高的反应温度下变性，这降低酶活性，由此造成生产的D-阿洛酮糖量减少的问题。因此，为了以高效用高效生产D-阿洛酮糖，迫切需要一种具有改良的耐热性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。

发明内容

技术问题

本发明人知道了衍生自根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-表异构酶归因于低热稳定性尽管有高活性而具有不良效用的问题，因此开发一种具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，以及使用这种突变体连续生产D-阿洛酮糖的方法，以便当前作为重要食品添加剂吸引了关注的D-阿洛酮糖工业上大规模地生产。

具体来说，本发明旨在提供一种具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其通过取代野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的特定位置处的氨基酸进行。

另外，本发明旨在提供一种多核苷酸，其编码具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。

此外，本发明旨在提供一种重组载体，其包含编码D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的基因。

此外，本发明旨在提供一种重组微生物，其经转型以生产D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体。

此外，本发明旨在提供一种使用D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体或经转型以生产D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体的重组微生物来从D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法。

技术解决方案

本发明提供一种具有改良的热稳定性的D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，以高效生产D-阿洛酮糖，其通过取代野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的特定位置处的氨基酸进行。

具体来说，本发明提供一种D-阿洛酮糖3-表异构酶突变体，其包含如下氨基酸序列，其中衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置77处的谷氨酸经脯氨酸取代。

所述突变体可以包含如下氨基酸序列，其中野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸进一步经由以下所构成的族群中选出的氨基酸取代：亮氨酸、半胱氨酸以及缬氨酸，和/或野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置213处的丝氨酸进一步经半胱氨酸取代。

所述突变体可以包含如下氨基酸序列，其中野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置33处的异亮氨酸进一步经亮氨酸取代，并且野生型D-阿洛酮糖3-表异构酶的氨基酸序列的位置213处的丝氨酸进一步经半胱氨酸取代。