[发明专利]用于产生用于定向进化的文库的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年2月26日提交的美国临时申请号61/769,517的优先权利益，所述美国临时申请在此通过引用并入。

发明背景

一般而言，本发明涉及改进的核酸文库产生。

多样化遗传序列的文库可以用于鉴定具有特定功能的蛋白。例如，商业上有价值的功能序列可以通过下述进行鉴定：表达多样化遗传序列的文库，就特定功能测试所得的蛋白，并且分离良好表现的那些序列。该过程可以被称为定向进化。通过多样化和选择的反复循环，序列可以进一步就特定功能进行最佳化。选自多样化序列库的序列可以用于生物学、医学或工业应用中。例如，通过定向进化鉴定的序列可以用于抗体工程改造中。

生成多样化遗传序列的文库的现有方法通常是无效的。例如，现有方法可以包括无效的连接步骤或需要昂贵的引物组。对已知方法的速度和成本效益的改进将增加文库生成的效率，允许多重功能序列的高流通量平行处理，并且促进新功能序列的鉴定。

发明概述

本发明包括生成目的序列的变体文库的方法。该方法可以包括下述步骤：首先提供包括目的序列的模板DNA分子，并且提供一对寡核苷酸，其中寡核苷酸之一可以是受保护的，并且另一寡核苷酸可以是未受保护的，并且其中寡核苷酸与目的序列的相反链杂交且侧接目的序列。后续步骤可以包括使用寡核苷酸对模板DNA分子进行扩增反应，从而生成dsDNA变体群体，随后为使dsDNA变体群体与酶一起孵育的步骤，所述酶能够相对于dsDNA变体的受保护链选择性降解未受保护的链，从而产生ssDNA变体群体。接下来，ssDNA变体群体可以与ssDNA中间体(intermediaries)杂交，其可以包括与目的序列或其片段基本上相同的序列，生成异源双链DNA。在异源双链DNA生成后，后续步骤可以包括将异源双链DNA转化到细胞内，从而生成目的序列的变体文库。

模板DNA分子可以是线性dsDNA分子、环状dsDNA分子、环状ssDNA分子、尿嘧啶化的(uracilated)环状ssDNA分子或甲基化的环状ssDNA分子。模板DNA分子的序列可以与ssDNA中间体的序列基本上相同。

目的序列可以大于100个碱基对，大于300、大于500或大于700个碱基对。目的序列可以是100-2000个碱基对、300-1500个碱基对或700-1200个碱基对。

在一些实施方案中，受保护的寡核苷酸可以是包括三个或更多个5'硫代硫酸酯的寡核苷酸。受保护的寡核苷酸可以包括三、四或五个5'硫代硫酸酯。未受保护的寡核苷酸可以是不包括三个或更多个5'硫代硫酸酯的寡核苷酸。在一些实施方案中，能够相对于受保护的链选择性降解未受保护的链的酶可以是T7核酸外切酶或λ核酸外切酶。在其他实施方案中，受保护的寡核苷酸可以是包括5'磷酸酯的寡核苷酸，并且未受保护的寡核苷酸可以是不包括5'磷酸酯的寡核苷酸。在此类实施方案中，能够相对于受保护的链选择性降解未受保护的链的酶可以是λ核酸外切酶。

在多个实施方案中，扩增反应可以是PCR反应、易错PCR反应、等温扩增反应或滚环扩增反应。在一些实施方案中，dsDNA变体群体的50%dsDNA变体与目的序列具有小于99.5%同一性，或与目的序列具有小于98%同一性。

上述实施方案中的任一个均可进一步包括在与能够相对于受保护的链选择性降解未受保护的链的酶一起孵育前，纯化dsDNA变体群体。上述实施方案中的任一个均可进一步包括在与ssDNA中间体杂交前，纯化ssDNA变体群体。

在上述实施方案的任一个中，ssDNA中间体可以包括与目的序列或其片段具有至少50%、至少70%、至少90%或100%同一性的序列。ssDNA中间体可以是包括与噬菌粒序列基本上相同的序列片段的噬菌粒或载体。

在上述实施方案的任一个中，ssDNA变体群体与ssDNA中间体的杂交可以包括ssDNA变体群体和ssDNA中间体在变性温度下的共孵育，随后逐步冷却至退火温度。变性温度可以是约90℃。退火温度可以是约55℃。逐步冷却以约-1℃/分钟的速率发生。

本发明的细胞可以是真核细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞。