[发明专利]用于检测囊性纤维化病的方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于同时测定囊性纤维化跨膜调节物(CFTR)核酸中的突变、缺失、重复和单核苷酸多态性的存在或缺乏的方法。还公开了用于扩增CFTR核酸的区域以进行高通量大规模并行测序的核苷酸序列(诸如对于引物)及测定个体的囊性纤维化病状态的方法。

发明背景

提供本发明背景的以下描述仅作为理解本发明的帮助，而并不承认描述或构成本发明的现有技术。

囊性纤维化病(CF)是高加索裔群体中的最常见的重度常染色体隐性遗传病症。它在北美影响着2,500个活产中的约1个(Boat等,TheMetabolicBasisofInheritedDisease,第6版,pp2649-2680,McGrawHill,NY(1989))。25个人中的约1个是该疾病的携带者。囊性纤维化病的主要症状包括慢性肺疾病、胰腺外分泌不足、和升高的汗液电解质水平。症状与作为外分泌病症的囊性纤维化病一致。虽然最近的进展已经在分析离子转运通过CF患者细胞的上皮的顶膜方面做出，但是不清楚氯化物通道的异常调节代表疾病中的主要缺陷。

CF的基因已经定位于染色体7的长臂上存在的250,000个碱基对基因组序列。此序列编码称作“囊性纤维化跨膜调节物”(或“CFTR”)的膜结合蛋白。CFTR基因中有大于1000种不同突变，其在目前对囊性纤维化病遗传分析协会报告的群体中具有不同的出现频率。这些突变存在于CFTR基因的编码区(例如ΔF508(一种存在于约70％CF等位基因上的突变)代表残基508处的苯丙氨酸缺失)和非编码区(例如5T、7T、和9T突变对应于位于内含子8的剪接分支/接受位点处的5、7或9个胸苷碱基的序列)两者中。CFTR基因组和cDNA序列的比较确认27个外显子的存在。外显子编号为1-27，如NCBI参照序列登录号NM_000492.3中显示。每个外显子侧翼有共有GT-AG剪接位点序列，如先前报告的(Zielenski等,(1991)Genomics10,214-228)。

已经描述了用于检测CFTR基因突变的方法。参见例如Audrezet等,“GenomicrearrangementsintheCFTRgene:extensiveallelicheterogeneityanddiversemutationalmechanisms”HumMutat.2004Apr；23(4):343-57；Spiegelman和Lem的PCTWO1004/040013A1及相应的美国申请#20040110138；题为“Methodforthedetectionofmultiplegenetictargets”；Dunlop等的美国专利申请No.20030235834；题为“Approachestoidentifycysticfibrosis”；及N.Broude的美国专利申请No.20040126760，题为“NovelcompositionsandmethodsforcarryingoutmultiplePCRreactionsonasinglesample”。

然而，目前必须采用多种不同分析和/或检测方法以精确获得全面序列数据。例如，可以采用传统的Sanger测序方法来测定牵涉CFTR基因中的少量核苷酸的突变的存在或缺乏。然而，Sanger测序不能检测大缺失和重复，诸如那些牵涉一个或多个外显子的。因此，需要别的方法如定量荧光聚合酶链式反应(QF-PCR)来检测这些较大的突变类型。

因而，需要改善的方法来有效检测CF下面的多种CFTR基因缺陷以及同时捕捉剂量数据(例如基因拷贝数)和序列数据两者。此外，需要改善的方法来检测CFTR基因中的罕见突变。理想地，可在单一测定法中检测多种类别的CFTR突变，如牵涉小碱基变化(例如错义突变、无义突变、小插入或缺失和/或剪接位点突变)的那些及牵涉较大缺失和/或重复的那些的方法是期望的。

发明概述

提供了用于测定样品CFTR核酸的核苷酸序列的方法，该方法(a)通过扩增所述样品CFTR核酸的多个靶区段而生成衔接头标签化的扩增子文库，并(b)通过使用高通量大规模并行测序对所述扩增子文库中的扩增子测序来测定所述靶区段的核苷酸序列。