[发明专利]功能性蛋白在范围广泛的革兰氏阴性细菌中的改善的表面展示

权利要求书

1.用于在宿主细胞的表面上展示重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供用可操作地连接有表达控制序列的核酸融合体转化的宿主细胞，所述核酸融合体包含：

(i)编码信号肽的部分，

(ii)编码待展示的重组多肽的部分，

(iii)编码跨膜接头的部分，和

(iv)编码EhaA蛋白的转运结构域的部分，

和

(b)在其中表达所述核酸融合体并且包含所述重组多肽的表达产物被展示在宿主细胞的表面上的条件下，培养所述宿主细胞，

其中所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌，前提是该革兰氏阴性细菌不是大肠杆菌，

所述EhaA蛋白的转运结构域(iv)由包含选自下列的序列的序列编码：

(a)包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列，

(b)编码SEQ ID NO：19的核苷酸序列，

(c)包含与SEQ ID NO：18和/或编码SEQ ID NO：19的序列至少95％同一的序列的核苷酸序列，和

(d)在遗传密码简并性的范围内编码由(a)、(b)和/或(c)编码的多肽的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的方法，其中所述细菌选自

肠炎沙门氏菌、运动发酵单胞菌、棕榈发酵细菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、钩虫贪铜菌、耐金属贪铜菌、荚膜红细菌、Acinetobacter baylyi ADP1、氧化葡糖杆菌、葡糖醋杆菌属某些种、酸单胞菌属某些种、木醋杆菌、脱氮副球菌、苜蓿根瘤菌、野油菜黄单胞菌。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸融合体的序列具有适应于宿主细胞的密码子使用。

4.权利要求1或2所述的方法，其中所述待展示的重组多肽选自内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶及其组合。

5.权利要求4所述的方法，其中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶的组合在细胞中共表达，或者内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶在单独的细胞中表达。

6.权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中所述编码EhaA蛋白的转运结构域的部分包含SEQ ID NO：18。

7.权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是棕榈发酵细菌或恶臭假单胞菌。

8.权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中所述核酸融合体还包含至少一种编码亲和标签的核酸序列。

9.权利要求8所述的方法，其中权利要求8中定义的核酸序列侧接于所述编码待展示的重组多肽的部分(ii)。

10.权利要求9所述的方法，其中权利要求8中定义的核酸序列通过编码至少一种蛋白酶识别序列的序列而与部分(ii)分开。

11.权利要求10所述的方法，其中所述至少一种蛋白酶识别序列独立地选自因子Xa切割位点、OmpT切割位点和TEV蛋白酶切割位点。

12.权利要求8所述的方法，其中所述亲和标签独立地选自His₆和表位。

13.权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中所述核酸融合体包含编码至少一种蛋白酶识别序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于部分(ii)和部分(iii)之间。

14.权利要求13所述的方法，其中所述至少一种蛋白酶识别序列独立地选自因子Xa切割位点、OmpT切割位点和TEV蛋白酶切割位点。

15.权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中所述编码待展示的重组多肽的部分(ii)由至少一种包含多克隆位点的序列侧接。