[发明专利]采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物

说明书

本发明提供用于修饰植物细胞以及源自其的植物和种子中的基因的改进方法。更具体地说，本发明涉及通过组合基因修复寡核苷酸与增强靶细胞基因修复机制的组分的可用性的方法来增加靶基因突变的效率。

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请 61/801,333的优先权，所述专利申请特此以引用的方式并入。

发明领域

本发明总体上涉及用于改进对基因组或其他核苷酸序列中的特定位置的修饰的靶向效率的新颖方法。另外，本发明涉及已经通过本文所公开的方法修饰、突变或标记的靶DNA。本发明还涉及已经通过本发明的方法修饰的细胞、组织和生物体。

发明背景

以下发明背景论述仅提供来帮助读者理解本发明，且并非承认描述或构成本发明的现有技术。

基因组DNA的修饰一般来说对生物技术的进步是至关重要的并且具体地说是生物技术上基于医学进步的。用于位点定向基因组修饰的有效方法对于研究且可能地对于基因疗法应用来说是合乎需要的。一种方法利用三链体形成寡核苷酸(TFO)，所述寡核苷酸以序列特异性方式结合双链DNA作为第三链以介导定向诱变。这种TFO可通过递送键结诱变剂如补骨脂素或苯丁酸氮芥(Havre等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.90:7879-7883,1993；Havre等,J Virol 67:7323-7331,1993； Wang等,Mol Cell Biol 15:1759-1768,1995；Takasugi等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.88:5602-5606,1991；Belousov等,NucleicAcids Res 25:3440-3444,1997)或通过以足够亲和力结合以引起易错修复(Wang 等,Science 271:802-805,1996)来作用。

用于基因组修饰的另一策略涉及诱导外源性DNA片段与靶基因之间的同源重组。这种方法已经成功地用于靶向并破坏哺乳动物中的选定基因并且已经实现携带特异性基因敲除的转基因小鼠的产生 (Capeechi等,Science 244:1288-1292,1989；Wagner的美国专利号 4,873,191)。然而，这种方法依赖于转移选择性标记物以允许所需重组体的分离。在无选择的情况下，典型基因转移实验中转染的DNA 的同源与非同源整合的比例较低，通常在1:1000或更小的范围内 (Sedivy等,Gene Targeting,W.H.Freeman and Co.,NewYork,1992)。同源整合的这种低效率限制基因转移用于实验用途或基因疗法的效用。同源重组的频率可通过对来自UV照射和选定致癌物的靶位点的损伤(Wang等,Mol Cell Biol8:196-202,1988)以及通过位点特异性核酸内切酶(Sedivy等,Gene Targeting,W.H.Freeman and Co.,New York, 1992；Rouet等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.91:6064-6068,1994；Segal 等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.92:806-810,1995)来增强。此外，由三链体定向补骨脂素光加成物诱导的DNA损伤能够刺激染色体外载体之内和之间的重组(Segal等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.92:806-810, 1995；Faruqi等,Mol Cell Biol16:6820-6828,1996；Glazer的美国专利号5,962,426)。

其他工作已经帮助定义影响哺乳动物细胞中的重组的参数。一般来说，线性供体片段比其环状对应物重组发生更强(Folger等,Mol Cell Biol 2:1372-1387,1982)。重组还受供体与靶部位两者之间的不间断同源性的长度影响，其中较短片段似乎是对于重组的无效底物(Rubnitz 等,Mol Cell Biol 4:2253-2258,1984)。然而，一些最近努力集中于使用DNA或DNA/RNA杂合体的较短片段用于基因校正。(Kunzelmann 等,Gene Ther 3:859-867,1996)。