[发明专利]新的RhtB蛋白变体和使用其产生O-磷酸丝氨酸的方法

说明书

本发明涉及具有增强的输出O‑磷酸丝氨酸(OPS)能力的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体——所述O‑磷酸丝氨酸是L‑半胱氨酸的前体、编码所述蛋白质的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述蛋白变体的产OPS微生物、使用微生物产生O‑磷酸丝氨酸的方法、和用于制备半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括使通过上述方法产生的O‑磷酸丝氨酸与硫化物在O‑磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下反应。

技术领域

本发明涉及具有增强的输出O-磷酸丝氨酸(OPS)能力的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体——所述O-磷酸丝氨酸是L-半胱氨酸的前体、编码所述蛋白质的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述蛋白变体的产OPS微生物、使用所述微生物产生O-磷酸丝氨酸的方法、和制备半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括使通过产OPS的方法产生的O-磷酸丝氨酸与硫化物在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下反应。

背景技术

L-半胱氨酸——在所有生物体中的硫代谢中起重要作用的氨基酸，不仅用于合成生物蛋白，比如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代谢产物，而且还作为用于生物合成辅酶A的前体。

使用微生物产生L-半胱氨酸的已知方法包括使用微生物将D,L-ATC生物转化为L-半胱氨酸(Ryu OH等人，Process Biochem.,32:201-209,1997)。另一个已知方法是通过使用大肠杆菌的直接发酵产生L-半胱氨酸(EP 0885962B；Wada M和Takagi H，Appl.Micrbiol.Biochem.,73:48-54,2006)。同时，本发明人发现了在某些微生物中从O-磷酸丝氨酸(OPS)合成L-半胱氨酸的酶(O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS))。基于此发现，本发明人开发了通过培养突变微生物以积累其中的OPS，从而通过使OPS与OPSS酶反应产生半胱氨酸的方法(韩国专利公开公布号10-2012-004111)。为了在高产率下产生半胱氨酸，仍存在产生过量的OPS的需要。因此，本发明人已经做了广泛的努力以发现使在产OPS菌株中产生的O-磷酸丝氨酸能够从细胞顺利地释放的适当的输出运载体(exporter)。此外，基于各种类型的已知的运载体，本发明人筛选了编码O-乙酰丝氨酸/半胱氨酸外排蛋白(effluxprotein)的ydeD、编码O-乙酰丝氨酸/半胱氨酸输出透性酶的yfiK(Franke I、Resch A、Dassler T和Bock A，J.Bacteriology,185:1161-166,2003)、编码高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白的rhtB(Zakataeva NP、Aleshin VV、Tokmakova IL、Troshin PV、Livshits VA，FEBS Lett 1999；452(3)；228-32)等，并且特别发现产OPS菌株中RhtB的增强导致OPS浓度增大(韩国专利公开公布号10-2012-004115)。然而，为了产生更高产率的半胱氨酸，仍需要开发具有从产OPS菌株输出前体OPS的更高能力的运载体。

发明内容

技术问题

本发明人已经做了广泛的努力以发现具有增大的OPS输出活性的RhtB蛋白变体以便能够进一步增大OPS的产生，结果，已经识别具有增大的OPS输出活性的四个新的RhtB蛋白变体，并且已发现所述蛋白质可更有效地从产OPS菌株输出OPS，从而完成本发明。

解决问题的方案

本发明的目的是提供具有增强的O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的RhtB(高丝氨酸/高丝氨酸内酯输出运载体)蛋白变体。

本发明的另一个目的是提供编码所述蛋白变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体。

本发明的又另一个目的是提供包含所述蛋白变体的产OPS微生物。

本发明的又另一个目的是提供用于产生OPS的方法，其包括培养微生物。