[发明专利]使用HLA标志物测定母体血液中的胎儿DNA的分数的方法

权利要求书

1.测定血液或血浆样品中胎儿核酸的分数的方法，其包括：

(a)定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；

(b)定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；

(c)使用步骤(a)和(b)中检测的量，测定所述样品中的胎儿核酸的分数。

2.权利要求1的方法，其中所述测定步骤包括计算步骤(a)中检测的所述非母本HLA等位基因的量与步骤(a)和(b)中测定的HLA等位基因的量的总和的比率的2倍。

3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述至少一种非母本和母本HLA等位基因包含选自以下的序列：HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述HLA基因的内含子序列或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：测序，具体而言克隆测序。

5.权利要求4的方法，其进一步包括在测序之前的目标富集步骤，且其中所述目标富集步骤包括至少一轮基因组DNA扩增或目标捕获。

6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：

(a)用正向引物和反向引物扩增，以获得HLA扩增子；

(b)进行克隆测序以测定步骤(a)中获得的HLA扩增子的序列；

(c)鉴定在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因和至少一种非母本HLA等位基因；

(d)比较步骤(c)中鉴定的母本和非母本HLA序列克隆的数目，从而测定所述样品中的胎儿核酸的分数。

7.权利要求6的方法，其中步骤(c)中的鉴定包括以下计算步骤：

(a)将在所述HLA基因座的序列与HLA序列数据库进行比较；

(b)将所述序列分选至对应于已知HLA等位基因的多个箱；

(c)将一个或两个多数序列鉴定为母本等位基因；

(d)将一个或两个最代表的少数序列鉴定为非母本等位基因。

8.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述HLA等位基因通过包括数字PCR的方法定量检测。

9.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述HLA等位基因通过包括以下的方法定量检测：

(a)将所述样品分成多个反应体积，各自包含零至近似五个拷贝的目标HLA等位基因；

(b)测定各反应体积中目标HLA等位基因的存在；

(c)将含有所述非母本HLA等位基因的反应体积的数目与含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反应体积的数目进行比较，从而测定所述样品中的胎儿核酸的分数。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其进一步包括独立获得在至少一个HLA基因座的父母一方或双方的基因型信息。

11.检测胎儿中的染色体异常的方法，其包括：

(a)提供来自怀有所述胎儿的母亲的血液样品；

(b)通过包括以下的方法测定所述样品中胎儿核酸的分数：定量检测所述样品中的至少一种非母本HLA等位基因；定量检测所述样品中在相同基因座的至少一种母本HLA等位基因；比较所述母本和非母本HLA等位基因的量，从而测定所述样品中的胎儿核酸的浓度；

(c)定量检测所述样品中的来自怀疑异常的至少一个染色体的基因座；

(d)确定步骤(c)中检测的染色体基因座是否以相对于步骤(b)中测定的胎儿DNA的浓度的异常量存在，从而检测染色体异常。

12.权利要求11的方法，其中所述至少一种非母本HLA等位基因选自HLA-A，外显子2和3；HLA-B，外显子2和3；HLA-C，外显子2和3；DQA1，外显子2；DQB1，外显子2和3；DPA1，外显子2；DPB1，外显子2；DRB1，外显子2；DRB3，外显子2；DRB4，外显子2；和DRB5，外显子2或来自所述基因的外显子和内含子序列的组合。