[发明专利]使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法

说明书

本发明提供扩增一含有短目标核酸片段的片段化的目标核酸的方法，使用一拼装序列将这些短片段转化为更长的序列，从而鉴定和检测这些序列。这对于试图在高度片段化的核酸样本中鉴定微小的遗传变异，诸如SNVs尤其重要。扩增伴随着所述短目标核酸序列与所述拼装序列的杂交，这些短序列作为延伸的引物。由于含有SNVs的所述片段的目标核酸作为在所述拼装序列上的引物使用，它们在扩增中被保存并且能被检测到。

相关申请的交叉引用

本申请是申请日为2013年3月15日、申请号为61/789,984的临时专利申请的非临时专利申请。

关于联邦研究或发展资助的申明

无

以光盘形式提交的相关参考资料

无

发明背景

(1)本发明的领域

本发明涉及扩增一含有短核酸片段的片段化的目标核酸的方法。具体地，使用一拼装模板拼装和延伸这些短核酸以产生用于进一步操作的更大的扩增子。

(2)背景技术描述

有许多样本类型的目标核酸被严重降解，导致标准分子的诊断试验难以检测目标核酸。更具体地，这些目标核酸比所述用于检测它们的试验的“足迹”更短。譬如，为了检测一拷贝数非常低的目标，一般会扩增所述目标。另外，在许多情况下，会期望高度特异地检测所述目标。这一检测常常在一单核苷酸变化的分辨率上。实行扩增时，如PCR反应，存在一正向引物、一反向引物和一检测探针。通常地，这些引物和所述检测探针至少在长度上约为20个核苷酸。假设所述引物和探针不存在部分重叠，那么要求所述目标至少在长度上为60个核苷酸以容纳这三个原件(即所述试验的足迹)的结合。而且，所述将被检测的期望的单核苷酸变化(SNV)可发生于所述目标核酸序列的任何位置。为了可靠地检测，所述单核酸变化必须定位在所述扩增的目标核酸之中(即在所述引物结合位点之内的所述扩增子的一区域之内)以使所述探针选择性地与该区域杂交。这有效地增加所述试验的所述潜在足迹到至少约100核苷酸的长度以用于该种检测。

在很多情况下，检测一在所述目标序列中的已知或未知的SNV要求进行所述检测的片段长达160个核苷酸。这在很大程度上归因于探针、引物和封闭探针在所述扩增子上的排列。

这一需求的挑战在于许多样本类型含有短至20-50个核苷酸长度的片段，通常归因于所述目标DNA或RNA的部分降解。这在RNA序列中是典型的，因为它们更容易降解。这也常见于特殊的样本类型，如尿液、血液样本，和进行甲醛固定石蜡包埋(FFPE)的、细针抽吸(FNA)的样本，其中交联的核酸随着储存变得降解程度更大。在尿液的情况下，由于通过肾脏的处理，核酸天生的以小片段的形式进入尿液。通常地，穿过所述肾脏的核酸片段的大小约为20-50个核苷酸或更小。

因此，需要延伸短目标片段的长度以进行更为有效率和准确的检测。这需要所述被扩大的目标短片段具有与所述短片段原始来源的序列具有相同的序列背景以使得进行适当的处理成为可能。本发明提供了方法以实现这一需要。

发明概要

本发明提供了使用拼装模板扩增一片段化的目标核酸的方法，所述拼装模板结合并延伸一目标核酸的短核酸片段以产生更大的扩增子来进行进一步操作。本发明的一方面是一扩增一含有短目标核酸片段的片段化的目标核酸的方法，因为其长度原因难以使用现有的技术扩增。在一实施方案中，所述片段化的目标核酸与一含有一与所述目标核酸基本上互补、却有显著不同的序列的拼装序列混合。一群短目标核酸片段退火与所述拼装序列结合，所述短目标核酸片段通过聚合酶在3’方向延伸以产生一群含有一群第一核酸和所述拼装序列的第一双重核酸。