[发明专利]尿液中核酸的检测

说明书

相关申请

本申请要求来自2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/802,131的优先权的权益，所述美国临时专利申请如同完全阐述一样全文并入本文。

公开内容的领域

本公开内容涉及用于存在于体液例如尿液中的核酸的稳健、准确且灵敏的检测的方法和组合物。

公开内容的背景

以前曾报道过血液中片段化的DNA跨越肾屏障(跨肾DNA(TransrenalDNA)或Tr-DNA)并且能够在受试者的尿液中检测到(Botezatu等人,ClinChem.46:1078-1084,2000；Su等人,JMol.Diagn.6:101-107,2004；和Su等人,AnnNYAcad.Sci.1022:81-89,2004)。

已经表明无细胞的跨肾-DNA(Tr-DNA)含有诊断标志物，诸如与大量的基因组DNA不同的特异性的已知序列的情况。例如，对由特征性突变引起的肿瘤-特异性DNA的检测可以用于肿瘤诊断，对孕妇的尿液中的Y染色体-特异性序列的检测可以用于测定胎儿的男性性别，以及对遗传疾病的突变特征的检测可为产前基因检测提供工具(Chan和Lo,SeminCancerBiol.12:489-496,2002；Goessl,ExpertRevMol.Diagn.3:431-442,2003；Su等人,JMol.Diagn.6:101-107,2004；Wataganara和Bianchi,AnnNYAcadSci.1022:90-99,2004；Botezatu等人,ClinChem.46:1078-1084,2000；和Ding等人,ProcNatlAcadSciUSA.101:10762-10767,2004)。

核酸生物标志物通常本质上是十分特异的，例如在单核苷酸替换、少量核苷酸的插入、少量核苷酸的缺失或重组事件的情况下。另外，生物标志物可以以低浓度存在于体液中，例如在低频事件或妊娠或疾病的早期的情况下。

本领域技术人员知晓基于PCR或其他扩增技术的用于检测特定的DNA或RNA序列的灵敏方法。分析了通过常规的基于二氧化硅的方法分离自血浆、尿液和粪便的无细胞DNA，并且发现该无细胞DNA包括约150个碱基对或核苷酸的DNA片段(Chan等人,CancerRes.63:2028-2032,2003；Botezatu等人,ClinChem.46:1078-1084,2000；Su等人,JMol.Diagn.6:101-107,2004；和Diehl等人,Gastroenterology135:489-98,2008)。然而，应该认识到DNA片段化很可能是随机的，并且因此感兴趣的靶序列可能在已经基本上被随机切割的DNA片段中。在通过随机切割产生的DNA片段群体中，给定的靶序列足够长以用作PCR模板的可能性与靶序列的长度成反比。这在以前已经被阐明(例如在美国专利公开号US2010/0068711A的图1中所示出的，在此通过引用以其全部将其并入)。

使用较短靶序列中的另一个益处是在无细胞DNA片段中可能存在单链断裂或切口。由于PCR反应需要模板以它们的单链形式，血浆及尿液中的无细胞DNA片段的有效长度比来自双链断裂物的片段化物(fragmentation)更短。

因此，使用较短的靶尺寸检测片段化的DNA中的特定序列是有优势的。但是当靶尺寸接近于或大于平均片段长度时难以获得该优势。用标准的基于二氧化硅的方法从尿液中制备的DNA含有两种级分。

第一种为高分子量DNA，其来源于脱落细胞。第二种为大约150-250个碱基对的低分子量，其为Tr-DNA级分(Botezatu等人,ClinChem.46:1078-1084,2000；和Su等人,JMol.Diagn.6:101-107,2004)。跨肾核酸的分离已经揭示了远少于150个碱基对的DNA及RNA片段在尿液中的存在(参见美国专利申请公开号US2008/0139801A1，在此通过引用以其全部将其并入)。

本文引用的文献不应被解释为反映承认任一篇是相关的现有技术。此外，它们的引用不指示对相关公开内容的检索。关于文献的日期或内容的所有声明基于可获得的信息并且不是对它们的准确性或正确性的承认。

公开内容的概述