[发明专利]焦磷酸解测序

说明书

技术领域

本公开内容大体涉及核酸分析，且更具体地，涉及使用纳米孔的核酸分析。

背景

当前商购可得的DNA测序平台相对昂贵。这些平台使用“边合成边测序”方法，这么称呼是因为DNA聚合物在检测每个单体(即核苷酸)加入到生长聚合物结构的同时进行合成。由于模板DNA链严格指导新DNA聚合物的合成，人们可从在合成期间被加入到生长链的一系列核苷酸单体推断出模板DNA的序列。检测单体加入的能力通过在生物体系中正常进行DNA合成的生化组分的特别工程化变体来增强。这些工程化组分制作昂贵，并在边合成边测序中以相对大量被消耗。此外，监测反应使用相对昂贵的硬件，诸如激光器、检测光学系统和复杂的流体递送系统。迄今最成功的商业平台甚至在边合成边测序可开始之前，还需要扩增DNA模板的昂贵的试剂和硬件。

已考虑其他测序方法以减少成本，增加通量，和/或者简化过程。这些方法之一基于将单链DNA穿过纳米孔，并且从所述链穿过时流经孔的离子流中的变化确定其序列。该“纳米孔-链”测序方法的替代是“纳米孔-外切核酸酶”测序，其包括外切核酸酶催化单磷酸核苷酸从DNA链上一次一个的去除和将释放的单磷酸核苷酸依序穿过纳米孔。然而，流过纳米孔的离子流中所得的变化相当小，并很难将一个核苷酸与另一个核苷酸区分开。已做出在消化前修饰DNA或在单磷酸核苷酸被释放后修饰其的尝试。然而，尽管有了这些努力，纳米孔-外切核酸酶测序迄今还未以商业可行性水平被证实。

简述

因此，存在对更成本效益、快速和方便的平台的需要，所述平台提供当前可用于测序核酸的那些的替代。本公开内容解决这一需求，并还提供了其他优势。

本公开内容提供了用于确定靶核酸序列的方法。所述方法可包括以下的步骤：(a)提供靶核酸；(b)使所述靶核酸与聚合酶接触，以从所述靶核酸中依序去除三磷酸核苷酸，其中被去除的三磷酸核苷酸具有多种不同的碱基部分；和(c)区分被去除的三磷酸核苷酸的不同的碱基部分，从而确定所述靶核酸的序列。

在一些实施方案中，用于确定靶核酸序列的方法可使用以下的步骤来进行：(a)提供具有两条链的靶核酸；(b)使所述靶核酸与聚合酶在通过焦磷酸解作用从所述两条链的第一条中依序去除核苷酸的条件下接触，从而依序产生具有多种不同的碱基部分的三磷酸核苷酸；和(c)区分依序产生的三磷酸核苷酸的不同的碱基部分，从而确定所述靶核酸的序列。

本公开内容还提供了一种装置，所述装置包括：(a)液体不可渗透的屏障，其将第一贮液器和第二贮液器分隔；(b)纳米孔，其被放置在液体不可渗透的屏障内形成通路，三磷酸核苷酸可通过所述通路从所述第一贮液器传送至所述第二贮液器；以及(c)在所述第一贮液器中的反应混合物，所述反应混合物包含聚合酶、具有两条链的靶核酸，以及焦磷酸解浓度的焦磷酸(pyrophosphate)。

附图简述

图1显示附连至纳米孔的聚合酶的焦磷酸解测序反应的图。

图2显示了使用附连至纳米孔的聚合酶，以及附连至液体不可渗透的屏障的模板核酸的焦磷酸解测序反应的图。

图3显示了用膜的焦磷酸解测序，该膜上接种了多个核酸模板。

详细说明

本公开内容提供了与标准边合成边测序(SBS)技术相比的呈逆转方式的测序核酸的方法。在特定实施方案中，本公开内容的方法利用了称为焦磷酸解作用的聚合酶的催化功能，该焦磷酸解作用在SBS技术中通常被中伤为不期望的矫作物的元凶。焦磷酸解作用导致了三磷酸核苷酸通过聚合酶从核酸链上的去除，而这正是驱动标准SBS技术的聚合反应的逆转。