[发明专利]在无蛋白培养基中悬浮培养的MDCK来源的细胞系和使用该细胞系扩增病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及能够在无蛋白培养基中悬浮培养的新的MDCK来源的细 胞系，以及用于使用这样的MDCK细胞系扩增病毒以生产疫苗的方法。

背景技术

通常，受精鸡蛋被用于流感疫苗生产。然而，使用受精鸡蛋具有以下 缺点：应养殖并管理适于生产的小鸡；应将流感疫苗生产调整到受精鸡蛋 的生产范围；以及鸡蛋蛋白不能被完全清除，致使疫苗不适于接种给对鸡 蛋蛋白过敏的人。

从很久之前，就已经进行了关于通过使用细胞培养来生产流感疫苗以 替换具有上述缺点的受精鸡蛋的研究。因为用于细胞培养的动物细胞是无 限供给的，所以使用细胞培养允许在短时间内大量生产。此外，其具有这 样的优点：可以将疫苗接种给对鸡蛋蛋白过敏的人；以及可以从细胞中分 离不能从受精鸡蛋中分离的流感疫苗。此外，与在受精鸡蛋中相比，在细 胞中扩增的病毒显示出更少的病毒抗原基因突变。

由犬肾建立的马丁达比犬肾(MadinDarbycaninekidney，在下文中 称作“MDCK”)细胞系显示出很强的表面粘附；已使用动物血清进行培 养；并且需要很大的空间进行大量生产，从而需要高的费用。另外，有报 道称贴壁MDCK细胞系显示出高致瘤性。

因此，需要开发适于使用不含动物来源血清和蛋白质的培养基悬浮培 养的新MDCK细胞系，与常规的贴壁MDCK相比，其显示出显著较低 的致瘤性。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供能够在无蛋白培养基中悬浮培养的新 的MDCK来源的细胞系，其具有低致瘤性且引起较少的病毒抗原变异， 因此可以用来生产用于疫苗的病毒。

本发明的另一个目的是提供用于使用所述MDCK来源的细胞系扩增 病毒以生产疫苗的方法。

根据本发明的一个目的，提供了能够在无蛋白培养基中悬浮培养的马 丁达比犬肾(MDCK)来源的MDCKS-MG细胞系(登记号 KCLRF-BP-00297)。

根据本发明的另一个目的，提供了用于扩增病毒以生产疫苗的方法， 其包括以下步骤：

1)用所述病毒感染MDCK来源的MDCKS-MG细胞系(登记号 KCLRF-BP-00297)；

2)培养经所述病毒感染的所述MDCK来源的MDCKS-MG细胞系； 以及

3)从步骤2)中获得的细胞培养物中分离所述病毒。

本发明MDCK来源的细胞系能够在无蛋白培养基中悬浮培养并且没 有细胞生长缺陷；对多种病毒表现出高且均一的生产力，同时引起较少的 病毒抗原变异和低致瘤性；并因此可以用来生产用于疫苗的病毒。

附图说明

在结合附图时，通过本发明的以下描述，本发明的上述和其他目的以 及特征将变得明显。

图1和图2分别示出了候选细胞系A在悬浮培养适应期间的细胞状 态和生长曲线。

图3和图4分别示出了候选细胞系B在悬浮培养适应期间的细胞状 态和生长曲线。

图5和图6分别示出了候选细胞系A和候选细胞系B的传代培养结 果。

图7至图9分别示出了H1N1、H3N2和乙型流感病毒在候选细胞系 A和候选细胞系B中之生产力的分析结果。

发明详述

本发明提供了能够在无蛋白培养基中悬浮培养的MDCK来源的 MDCKS-MG细胞系(登记号KCLRF-BP-00297，下文中也称作“候选 细胞系B”)。

在不包含动物来源物质的无蛋白培养基中悬浮培养的本发明MDCK 来源MDCKS-MG细胞系没有细胞生长缺陷，表现出低致瘤性，并且对 多种病毒显示出高且均一的生产力。

此外，与在EX-CELLMDCK培养基(市售的无血清培养基)中悬 浮培养的其他MDCK细胞系(例如，候选细胞系A)相比，在无蛋白 ProCHO5培养基中悬浮培养的本发明MDCK来源的MDCKS-MG细胞 系显示出高达128倍更高的HA效价和高达10⁵倍更高的PFU效价，表 明了非常优异的流感病毒生产力(表5至表9)。而且，与候选细胞系A 不同，本发明的细胞系在培养3代后未显示出病毒HA-抗原的氨基酸序列 突变(表11)，并且具有相对较低的致瘤性(表13)。此外，由本发明细 胞系生产的流感疫苗在小鼠中显示出优异的抗体形成能力(表14)。因此， 该细胞系可以用来生产用于疫苗的病毒。