[发明专利]用于使用多种染料评估分子链片段长度的方法

说明书

用于可视化并区分布置在共同电泳凝胶通路中的样品中的未知长度的DNA/RNA片段和已知长度的内部标记物的方法。该方法包括将DNA/RNA片段用第一染料标记并将内部标记物用第二染料标记。该第一和第二染料具有分离的荧光发射光谱，其可以用于在视觉上区分DNA/RNA片段和内部标记物。

背景技术

基于片段长度电泳分离核酸(DNA/RNA)链(借助凝胶或毛细管)是实验室遗传学中广泛使用的工具。该方法用于评估DNA/RNA样品中片段长度的分布。电泳分离之后的DNA/RNA可视化依赖于将一种或多种染料分子附着于DNA/RNA。可以使染料分子激发荧光以确定DNA/RNA在凝胶柱、通道或其他通路(除非另外表明，在下文中统称“通路”)中的位置，DNA/RNA沿该凝胶柱、通道或其他通路穿过电泳。DNA/RNA片段长度分布的解释一般依赖于与至少一个尺寸参照物，且优选地多个尺寸参照物之间的比较，该尺寸参照物是由分离的、已知尺寸的DNA/RNA(“标记物”)组成的。标记物可以以不同的形式实现，但常用的优化尺寸准确度的方法是使标记物包括在与片段化DNA/RNA相同的电泳通路中。

一个目前用于使用电泳评估DNA/RNA片段的尺寸的优选方法包括，在开始电泳将已知的标记物包括在这种片段的样品内，即使用内部标记物。然而，由于DNA/RNA样品和标记物通常均结合有相同的染料以便使其在通路内可视化，因而如果存在大浓度的与标记物同样尺寸且具有相同长度的DNA/RNA片段，则可能难以或不能区分这二者。在这种情形下，来自附着至DNA/RNA样品片段的染料的荧光将经常掩蔽标记物染料的荧光。该后果导致对DNA/RNA片段长度的不准确尺寸估计，以致于不能区分内部标记物以提供用于对比的参照。

掩蔽内部标记物的荧光信号的问题可以通过选择允许它们区别于样品的尺寸的内部标记物，而在很大程度上得以避免。例如，Bioanalyzer 2100毛细管电泳系统(AgilentTechnologies)利用具有一种非常小(～15-50bp)且另一种非常大(～1.5-17kbp)的两种内部标记物的系统以自动评估DNA/RNA的片段长度分布。通过选择不同长度的内部标记物，在统计上最小化了样品DNA/RNA和标记物之间片段长度显著重叠的可能性。

虽然使用不同长度的内部标记物可以绕过上述掩蔽的问题，但当内部标记物为更近似样品的尺寸时，片段长度估计的结果会改善：可以通过使用更适合尺寸的内部标记物提供更准确的DNA/RNA片段长度估计，然而，这样做增加了不希望的荧光掩蔽的可能。

另一种用于使用电泳估计DNA/RNA片段尺寸的途径包括使用外部标记物，即将标记物引入与加载有DNA/RNA样品的通路(泳道，laneway)相邻的通路中。在电泳完成后，可以通过将它们与外部标记物通路比较，估计样品通路中的片段长度。

可以适当选择外部标记物片段的尺寸以匹配样品片段的尺寸范围；它们之间没有任何重叠或荧光饱和的可能性(机会)。然而，由于外部标记物和DNA/RNA样品之间施加的电流和通路(泳道，laneway)基质组成(matrix composition)的差异可以混淆尺寸的估算，因此该比较不是最佳的。此外，实际的样品成分可以影响片段的移动性，因而通道之间相同分子的迁移速度可以取决于剩余的样品组成而不同。为了消除(解决，account for)差异并改善片段长度估计，最好将标记物与DNA/RNA样品包括在同一通路中。

最后，另一种用于评估片段长度的方法包括将具有独特的激发/发射光谱的荧光染料的内部标记物标记在DNA/RNA分子的末端。然而该方法具有局限性。因为仅将染料分子附着于内部标记物的末端，由这种标记物分子发出的任何信号都非常小，且仅可由高灵敏度的、高成本的，不与凝胶电泳相兼容的探测器(检测器，detector)探测。此外，较大的标记物(即大于2500bp)具有过高的DNA/RNA片段/染料分子比例。并且，因为可以加载的标记物的绝对质量具有实际的上限，该比例阻止了使用大的内部标记物，即使是用于具有高灵敏度探测器的分析系统(即毛细管系统)。

发明内容