[发明专利]液滴储存方法

说明书

本发明提供一种储存液滴流的方法，所述液滴的至少一些包含一种或多种单核苷酸和/或寡核苷酸以及液滴流体。其特征在于，在相应的唯一位置将每个液滴依次引入至基板的表面上的步骤，并且其特征还在于通过下列过程制备所述液滴流：所述过程包括由分析物通过逐步焦磷酸解或核酸外切生成有序的核苷酸流并且液滴将每个核苷酸捕获在相应液滴中的步骤。所述方法可以有利地与微液滴测序仪和分析单元一起使用，其中使用荧光光谱法确定前体多核苷酸分析物中核苷酸的序列。还描述了用于执行所述方法的设备。

本发明涉及在基板表面上储存液滴的方法。具体地，其涉及各自含有一个或多个单核苷酸或寡核苷酸的液滴的储存。所述方法可以用于非常大量的微液滴的储存和表征，如可以在来源于天然存在的或合成的DNA或RNA的多核苷酸分析物的测序中生成的。

遗传物质的下一代测序已经总体上对生物科学并且由其是医学产生了显著影响，因为测序的单位成本随着越来越快的测序机器的上市而降低。因此，在一种这样的机器中，通过首先分解为多个较小的多核苷酸片段将双链DNA分析物间接测序，所述多核苷酸片段中的每一个首先在一条链的两端腺苷酸化，从而单链第一寡核苷酸可以通过与未配对的腺嘌呤碱基杂交结合至其互补体的两端。之后对由此得到处理的片段进行尺寸选择并且捕获在涂布有结合的单链第二寡核苷酸的表面上，所述第二寡核苷酸本身是与第一寡核苷酸的序列互补体，从而实际上可以通过进一步杂交形成表面结合的双链片段的文库。在随后的聚集步骤中，之后在表面上使用延伸和等温桥连反应将这些文库成分克隆扩增数百万次以利用未使用的第二寡核苷酸。实际上，这产生了致密浓度的通过其链中的一个结合至表面的多核苷酸片段。之后移除每个片段的未结合的互补链以留下结合的单链片段准备用于测序。在测序阶段中，引发这些单链片段中的每一个，并且其互补链使用聚合酶链式反应和双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)形式的DNA的四种特征性核苷酸碱基的混合物通过延伸重新形成。每种ddNTP类型是用在不同波长发荧光的不同荧光团标记的部分末端封闭的。之后延伸反应采取三步骤循环的形式；首先相关ddNTP结合至生长链；其次，通过照射样品并且检测荧光的波长来确认其含有的核苷酸碱基以及最终移除末端封闭及其相关的荧光团以允许接下来的延伸事件发生。通过这种方式，可以逐个碱基地构建互补链的序列。将理解的是，尽管这个途径可以是高度自动化的并且可以生成高准确性的序列读取，其操作速度受延伸循环速率的限制。因此，在实践中，技术的使用倾向于包括平行加工相对短的多核苷酸片段和组装来自由其得到的各种读取的整个序列。这本身可能会导致计算的复杂性和潜在的误差引入。

最近已经做出努力，开发备选的直接测序方法。例如，WO 2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中尤其是单链或双链多核苷酸样品(例如，天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其转运通过纳米孔基板而被读取，所述纳米孔基板设置有在纳米孔的出口内或附近并置的等离子纳米结构(plasmonic nanostructure)。在这种设备中，等离子纳米结构限定了检测窗口(基本上为电磁场)，在其中通过与入射光的相互作用以特征性的方式依次诱导每个核苷酸碱基(任选标记的)发荧光或拉曼散射光子。之后远程检测由此生成的光子，放大并且转换为数据流，其信息内容是与多核苷酸相关的核苷酸碱基序列特有的。这种序列之后可以使用在编程至与其整合的微处理器中或与其连接的辅助计算设备中的相应软件中包含的计算算法来从数据流中找回。在例如Adv.Mat.2004,16(19)pp.1685-1706中，可以发现使用等离子纳米结构及其相关的共振特征的进一步背景。

例如，在US6627067、US6267872和US6746594中描述了另一种用于快速测序多核苷酸的装置。以其最简单的形式，这种设备采用电极代替等离子纳米结构来限定整个基板中或者在纳米孔的出口中或周围的检测窗口。之后在整个电极中施加电势差并且，并且作为时间的函数测量在其之间流动的离子介质的电特征的变化，所述变化是多核苷酸和相关的电解质通过纳米孔的电泳转运的结果。在这种装置中，在各个单独的核苷酸碱基通过检测窗口时，它们连续地阻塞和开启所述检测窗，引起产生电流或电阻率的特征性波动的‘事件’。然后，利用这些波动来生成适当的数据流，用于如上所述的分析。