[发明专利]改进的NGS工作流程

说明书

技术领域

本发明涉及核酸序列分析领域。具体地，本发明涉及关于下一代测序(NGS)的方法和工具。DNA测序是一种用于破译一些人类疾病(所述疾病包含涉及癌症的形成的不同类型的基因)的有力方法。

背景技术

下一代测序(NGS)技术的出现成数量级地降低了测序成本并且显著地增加了通量，从而使全基因组测序成为用于获得关于可被采取临床措施的患者的整体基因组信息的可行方式。DNA测序可被用于确定个别基因、较大基因区域(即，基因或操纵子的簇)、全部染色体或整个基因组的序列。取决于使用的方法，测序可以提供DNA中或从动物、植物、细菌等的细胞或者实际上任何其他基因信息源分离的核苷酸的序列。得到的序列可被分子生物学或遗传学的研究者使用，并且可被用于进一步的科学进程，或者可被医务人员用来做出治疗决策或帮助基因咨询。后两种用途经常在具有个体化治疗或伴随诊断应用的背景中引用。

无论NGS技术提供多大的利益，在NGS技术可以从研究工具变成常规临床实践之前必须充分解决一些挑战。为了诊断目的的NGS技术应当需要尽可能少的手动步骤，包括适当机制以防止被源于临床样品(所述临床样品在给定时间点进行分析)之外的其他来源的核酸材料污染，并且所述方法应当快速并且应当被在临床实验室工作的人员容易地执行。

已经发展了不同NGS技术，其涉及多种物理-化学机制，导致相应核酸序列分析中使用不同方法。这些技术在本技术领域中通常是已知的。最广泛应用的技术是离子半导体(IonTorrent)测序、焦磷酸测序和合成测序(Illumina)。

定义

已经一般性描述了本发明的方法，将更详细地描述所述方法的每个方面。

如本文使用的，被测序的核酸称为目标核酸(或目标)。目标核酸包括但不限于DNA(例如但不限于基因组DNA、线粒体DNA、cDNA等)和RNA(例如但不限于mRNA、miRNA)，等。目标核酸可来源于任何来源(包括天然存在的来源或合成来源)。核酸可以是PCR产物、粘粒、质体、天然存在或者合成库的成员或种类等。本发明不意在限于此点。核酸可以来自动物或病原体来源，包括但不限于哺乳动物(例如人)和微生物(例如细菌、病毒、真菌、寄生物和分枝杆菌)。在某些实施方式中，核酸不是病毒核酸。目标核酸可以从任何体液或组织(包括但不限于血液、唾液、脑脊髓液(“CSF”)、皮肤、毛发、尿液、大便和粘液)获得。目标核酸可还来源于但不限于，环境样品(例如水的样品)、食品样品、或法医样品，所述样品可以是新鲜样品(例如，直接进行核酸提取的活检材料)或者已被处理以便允许存储的样品(例如，被福尔马林固定的和/或石蜡包埋的样品(FFPE样品))。

使用本领域中任何已知方式来制备目标核酸。作为实例，可以根据本领域中公知的技术(见例如Sambrook等的‘Maniatis’)从样品来获得基因组DNA。在获得之后，DNA可以被片段化以便生成具有较短长度的核酸。形成的片段可具有数百、数千或数万个核苷酸的长度数量级。在某些实施方式中，片段具有50-1000个核苷酸长度、100-1000个核苷酸长度、200-1000个碱基对长度或300-800个碱基对长度，而它们并不限于这些长度。核酸可以通过任何方式片段化，包括但不限于机械、酶促或化学方式。实例包括剪切、超声处理、雾化和核酸内切酶(例如，脱氧核糖核酸酶I)消化或者本领域中已知的任何其他技术，以便产生核酸片段(优选地具有期望长度的片段)。片段化之后可以是大小选择技术，用于将具体长度的片段富集或分离。这种技术在本领域中也是已知的，并且包括但不限于凝胶电泳或SPRI。

可选地，可以使用已经具有期望长度的目标核酸。这种目标核酸包括来源于外显子富集方法的那些核酸，对于在测序之前分离和/或富集序列(例如外显子)的方法，参见Albert等NatMeth4(11)：903-905(2007)、Porreca等NatMeth4(11)：931-936(2007)、Okou等NatMeth4(11)：907-909(2007)。因此，除了片段化(随机地或非随机地)较长的目标核酸，目标可以是天然存在的或可被以较短的可用长度分离的核酸，例如mRNA、cDNA、外显子、PCR产物(如上面描述的)等。

通常，目标核酸在5′和3′端中的一端或两端连到序列。这些接头序列包括测序引物位点(即，测序引物将杂交到的位点)，所述测序引物位点将被用于本发明的测序方法中。