[发明专利]芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产

说明书

发明领域

本发明涉及一种在芽孢杆菌属宿主细胞中生产不具有分泌信号的天然非分泌多肽并且无需进行裂解步骤来回收该天然非分泌多肽的方法；并且涉及包括一种或多种外源或异源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞，该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌感兴趣多肽。

发明背景

芽孢杆菌属宿主细胞已经被表征为工业制造各种感兴趣多肽的主力，主要是因为它们主动分泌具有所谓信号肽的多肽。该信号肽是一种小多肽，典型的是约20-30个氨基酸，该小多肽在与待分泌多肽的N-末端的转录和翻译融合体中表达。它引导该融合的多肽进入适当配备的宿主细胞的分泌机构中，于是该融合的多肽裂解，这时不具有其信号肽的现已成熟的感兴趣多肽被分泌进入周围培养液中，该信号肽保留在细胞中并且被降解。

芽孢杆菌属中重组生产的感兴趣多肽的分泌能够使得不用必须进行细胞裂解步骤而直接从培养液中比较容易地回收多肽。在芽孢杆菌属中，只有肯定会从细胞输出至生长培养基中的多肽是天然具有信号肽的。

然而，细胞中大多数的多肽不是肯定会输出的，而是相反原本在细胞内、周质、膜结合的等等。生产此类天然非分泌多肽通常被认为是繁重的，因为它们需要从宿主细胞内进行回收，这些宿主细胞通常需要凌杂的细胞溶解步骤，这导致了挑战性的回收过程，或者它们需要被表达为与异源性分泌信号一起的人工融合多肽，希望这将使得来自像芽孢杆菌属的宿主细胞能主动分泌，但这不是绝对能保证成功的。因此，在本领域存在着对以经济有效的途径生产天然非分泌多肽的方法的需要。

发明概述

与我们的预期相反，当天然细胞内的或非分泌的酶在不具有信号肽的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌宿主中表达时，我们在上清液中发现了非常高水平的酶活性。这是一个非常出人意料的结果并且是一个具有经济重要性的结果，因为这证实了天然非分泌多肽可以在芽孢杆菌属中产生并且可以无需昂贵的细胞裂解步骤直接从培养液中回收。

在以下实例1中，将过表达不具有信号肽的天然非分泌天冬酰胺酶(ASP)的枯草芽孢杆菌菌株和过表达不具有信号肽的天然非分泌葡聚糖转移酶(GT)的地衣芽孢杆菌菌株或不具有信号肽的GFP变体，分别与不具有ASP/GT/GFP-变体编码基因的对照菌株进行比较。这些ASP、GT和GFP-变体编码基因在没有分泌信号的情况下进行表达，该分泌信号另外被认为是芽孢杆菌属细胞主动分泌所需要的。非常出人意料的是在芽孢杆菌属宿主的上清液中发现了高水平的酶活性。但是这是一个非常受欢迎的惊喜，我们可以在芽孢杆菌属宿主细胞中不必进行昂贵的裂解步骤，重组地生产在天然细胞内的或非分泌的没有信号肽的多肽，因为这允许更加具有成本效益的生产。

因此，在第一方面，本发明提供了在芽孢杆菌属宿主细胞中生产感兴趣多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

i)在生长培养基中，在有助于表达该多肽的条件下，培养包括一种或多种外源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞，该一种或多种外源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌的感兴趣多肽；并且

ii)无需进行裂解步骤回收该多肽。

在第二方面，本发明涉及包括一种或多种外源或异源多核苷酸的重组体芽孢杆菌属宿主细胞，该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌的感兴趣多肽。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

细胞裂解步骤：术语“细胞裂解步骤”意指一种在回收期间引入的加工步骤，以导致芽孢杆菌属细胞的裂解。实例包括向耗尽的发酵培养基添加酶，例如，溶菌酶；超声处理；均质化、冻结并研磨，和珠磨裂解。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。