[发明专利]复合可见着色剂及用于定量扩增的方法

说明书

提供了包含至少一种视觉上可检测的惰性染料和至少一种钝态参比染料的储备溶液以及这种储备溶液与无色的实时PCR主混合物联用的方法。该储备溶液可以添加到预先制备的实时qPCR主混合物中，该主混合物本身能够支持扩增。因此，储备溶液与主混合物的合并能够产生有色的主混合物，着色后便于追踪，将支持扩增。

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年10月10日提交的美国临时专利申请号61/889,358的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

实时qPCR能够实现实时的荧光检测和DNA扩增的测量，常用于在许多分子生物学和生物技术应用中输入DNA模板的准确定量。存在几种实时qPCR化学法，最常用的两种是：dsDNA结合(插入)荧光染料，例如SYBR绿色，和5’-核酸酶水解荧光探针(TaqMan)方法。TaqMan方法采用多种荧光报告染料，例如FAM、VIC、NED、5-和/或6-羧基-X-罗丹明(例如，以ROX^TM和SuperROX^TM商业购得(来自加州佩塔卢马的生物研究技术公司(BiosearchTechnologies))和CY5，其中每一种具有不同的发射光谱用于检测和测量单个反应中的多个靶DNA序列扩增。

存在许多不同的实时设备平台，例如来自应用生物系统公司(AppliedBiosystems)的7500和7900，来自伯乐公司(Bio-Rad)(iQ5和CFX96/384)，其中的一些需要内部钝态(passive)参比荧光染料用于孔与孔之间的报告子染料荧光信号标准化以改善定量准确性。荧光染料ROX或FRET ROX常用作qPCR和RT-qPCR主混合产品中的钝态参比染料(例如，参见美国专利号5,736,333)。由于热循环器设计的差异，一些设备采用高浓度的5-或6-羧基-X-罗丹明染料实现标准化，而其他则采用低浓度。标准ROX染料的激发/发射最大值在586/610nm，可以在7500上和其他“低ROX”设备上有效激发，提供给每个不同的荧光团通道不同激发波长的光。ROX染料在7900“高ROX”设备上不能被高效激发，仅仅提供单一的488nm激光用于激发所有不同的荧光团，因此需要较高浓度的ROX来产生所需的参比信号强度用于标准化。通常，“高-ROX”平台采用的ROX浓度比“低ROX”平台采用的浓度高约10-倍。

FRET ROX是一种基于FAM/ROX FRET-的寡聚偶联，可以在586nm处最大值激发作为标准ROX染料，也可以在约488nm处激发用于FAM荧光团，一旦被激发将能量转移至ROX荧光团以在610nm最大值处发射荧光。参见例如，美国专利号5,736,333。含单一浓度的FRET ROX的qPCR主混合物可用于所有不同的依赖ROX的设备，不论是低ROX或是高ROX设备。含有限定浓度比例的发射光谱最大值类似于ROX但可以在约488nm处被激发的斯托克斯长位移荧光染料和标准ROX染料的qPCR主混合可用作类似于FRET ROX的通用的ROX参比染料，且可用于不同的依赖ROX的qPCR设备上。参见例如，美国专利公开号2012/0164690。

微孔板上PCR和其他核酸扩增反应设定可包括移液(1)含有除了核酸模板之外的所有试验组分的主反应混合物，和(2)分别进入各反应孔的含有核酸(例如DNA)模板组分的DNA样品。如果在含有少量体积的微孔板上进行，容易丢失组分是否移液到孔中的痕迹，尤其是在采用白色和非透明孔板的情况下。因此，产生反应设定误差，导致失败的PCR反应。已经采用含惰性可见染料的PCR主混合物来尽可能减小常规PCR和实时PCR的移液误差，市售产品可得，例如西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)的RedTaq ReadyMix PCR反应混合物，赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)的Absolute Blue qPCR混合物，DyNamoColorFlash qPCR试剂盒，和Luminaris Color qPCR主混合物，以及生物科技公司(LifeTechnologies)的TaqMan GTXpress主混合物(含痕量染料)。

发明内容