[发明专利]用于抑制血栓形成的组合物和方法

说明书

相关申请

本申请要求于2013年7月1日提交的美国临时申请No.61/841,642 的权益。

上述申请的全部教导均通过引用并入本文。

背景技术

凝血(也称为血栓形成(thrombogenesis))是一个重要的生理过程， 其在受伤和组织损伤事件中防止血液从身体过量损失。凝血过程在很大程 度上通过血浆中存在的不同蛋白质进行协调，特别是伴随酶促反应的复杂 级联(称为凝血级联)的那些。尽管凝块(血栓)的生理形成对止血和保 持血容量至关重要，但是异常和致病性血栓形成与多种心血管疾病有关 [Peter，K.和G.Y.Lip，ThrombHaemost，2010.103(5)：875-6]。

凝血级联是调节血栓形成的关键过程并且可分为三条途径：内源性途 径、外源性途径和共同途径[Johari，V.和C.Loke，DisMon，2012. 58(8)：421-3]。参与外源性途径和共同途径的蛋白酶(例如因子X(Factor X，FX)、凝血酶和组织因子)是抗血栓形成设计的流行药物靶标，因为 抑制这些蛋白质的功能可容易地在血液的凝块形成中实现高抑制效力 [Danalev，D.，MiniRevMedChem，2012.12(8)：第721-30页]。然而，当 用于抗血栓形成目的时，目前靶向这些靶标的经批准药物均与过度出血的 高风险相关。

因此，需要经改善的抗凝血组合物和方法以使最常见和严重的副作用 过度出血最小化，在市场上见到的很多现有抗凝血剂中均可观察到过度出 血。

发明内容

如本文中所述的，对金环蛇(Bungarusfasciatus)毒液进行分级并 检测其对人血浆的凝血酶原时间(prothrombintime，PT)和活化的部分 凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime，aPTT)的作用。 将延长aPTT但使PT不受影响的级分通过质谱法、蛋白质测序和圆二色 谱学进行进一步分析，并根据针对不同凝血酶的特异性进行筛选。将分离 的候选肽通过一系列功能性测定进行进一步表征，所述测定包括抑制动力 学、western印迹、表面等离子体共振和凝血测定。

纯化对FXIa表现出高度特异性抑制的kunitz型蛋白酶抑制剂(称 为BF01或Fasxiator)。将该蛋白质在大肠杆菌(Escherichiacoli)系统 中重组表达并通过Ni-NTA珠进行纯化。BF01的重组形式(rBF01)延长 aPTT，并且证明其以剂量和时间依赖性方式与FXIa相互作用并抑制 FXIa，而并未观察到对凝血途径中其他蛋白酶(激肽释放酶、FXIIa、FXIa、 FXa、FIXa、FVIIa、尿激酶、α-凝血酶)的抑制。使用western印迹通 过探测FIX和FIXa观察到rBF01对FXIa切割FIX具有抑制作用。还 进行了rBF01的诱变分析，其产生具有高得多效力的突变体(例如，约 100至1000倍，具有一个或更多个残基替换)。

因此，BF01是一种高度特异性的抗凝血蛋白，其靶向内源性途径中 的FXIa，但却不接触凝血级联的外源性途径和共同途径。因此，BF01代 表一种新的具有最小出血副作用的抗凝血剂，所述出血副作用与当前批准 的很多抗凝血剂相关。

因此，在一个方面，本发明涉及(一种或更多种)分离的肽，其包含 BF01肽、BF01肽的变体和/或BF01肽的突变体。

在另一个方面，本发明涉及在有此需要的个体中抑制血栓形成的方 法，其包括施用有效量的(一种或更多种)BF01肽、其一种或更多种变 体和/或其一种或更多种突变体的全部或生物活性部分。

在另一个方面，本发明涉及在有此需要的个体中选择性地抑制内源性 凝血途径的方法，其包括施用有效量的(一种或更多种)BF01肽、其一 种或更多种变体和/或其一种或更多种突变体的全部或生物活性部分。

在又一个方面，本发明涉及在有此需要的个体中选择性地抑制FX1 的方法，其包括施用有效量的(一种或更多种)BF01肽、其一种或更多 种变体和/或其一种或更多种突变体的全部或生物活性部分。

附图简述

图1A至1B：检查组分的分子量低于8KD的合并HPLC级分对活 化的部分凝血活酶时间(aPTT)(图1A)和凝血酶原时间(PT)(图1B) 的延长。