[发明专利]新的有机酸通路

说明书

本发明涉及细胞质柠檬酸合成酶在微生物或藻类的线粒体外异源性生产柠檬酸盐的应用，其中所述蛋白选自黑曲霉(A.niger)An08g10920、An01g09940、An09g03570或这些基因的直系同源物。通过将编码上述蛋白的核酸引入到合适的宿主细胞中，来实现上述生产。上述蛋白优选是黑曲霉(A.niger)An08g10920、An01g09940、An09g03570或其直系同源物，更具体地，其中上述直系同源物选自下组：图9所列出的蛋白，以及与An08g10920、An01g09940或An09g03570具有70％、更优选75％、更优选80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％、更优选98％、更优选99％的百分比同一性的蛋白。

技术领域

本发明涉及微生物生产的领域，更具体涉及有机酸，诸如柠檬酸及其衍生物，诸如草酰乙酸、衣康酸(衣康酸盐)和甲基丙烯酸的生产，更具体涉及上述物质在微生物中的生产。

背景技术

在活的生物体中，最基础且最普遍的代谢途径之一是柠檬酸循环或以发现者的姓名命名的克雷伯氏(Krebs)循环。在真核生物中，这一过程发生在线粒体中并且主要注入从细胞质转运到线粒体内的丙酮酸盐和乙酰辅酶A(CoA)。通过主动转运机制，通常通过三羧酸转运蛋白，可将Krebs循环的一些组分或其衍生物转运回细胞质中。这主要意味着，依赖于或起始于有机酸，诸如柠檬酸(柠檬酸盐)、苹果酸(苹果酸盐)、草酰乙酸(草酰乙酸盐)的细胞质代谢通路，极大地依赖于并且通常受限于Krebs循环内的活性和三羧酸转运蛋白的可利用性。

迄今为止，还没有阐明线粒体外产生柠檬酸的具体代谢途径。然而，细胞质中的柠檬酸可利用性对于产生这种酸自身是极其有用的，甚至更重要的是，对于柠檬酸的衍生物和代谢物的产生也是极其有用的。柠檬酸是很多代谢途径的起始点。一个重要的代谢途径是衣康酸的产生。

已经对微生物细胞中的衣康酸的产生和代谢进行了几十年的广泛研究(Calam,C.T.et al.,1939,Thom.J.Biochem.,33:1488-1495；Bentley,R.and Thiessen,C.P.,1956,J.Biol.Chem.226:673-720；Cooper,R.A.and Kornberg,H.L.,1964,Biochem.J.,91:82-91；Bonnarme,P.et al.,1995,J.Bacteriol.117:3573-3578；Dwiarti,L.et al.,2002,J.Biosci.Bioeng.1:29-33)，但是还没有明确建立衣康酸的代谢通路(Wilke,Th.andVorlop,K.-D.,2001,Appl.Microbiol.Biotechnol.56:289-295；Bonnarme,P.et al.,1995,J.Bacteriol.177:3573-3578)。这一方面的两个并发性因素是，衣康酸的生物合成途径被认为即发生在细胞质中也发生在线粒体中(Jaklitsch,W.M.et al.,1991,J.Gen.Microbiol.Appl.6:51-61)，而且已发现乌头酸酶(使柠檬酸与顺乌头酸互变的酶)和代谢通路中的其他酶以很多亚型的形式存在于微生物细胞中。

在图1中，给出了目前所设想的衣康酸生物合成的一般线路图，其中，清楚示出在细胞质和线粒体中都存在生物合成途径，并且在两个区室之间存在假定的连接。这一线路图的几个点上，存在试图改善目前在微生物中所进行的衣康酸商业生产的可能性。

使用在WO 2009/014437、WO 2009/104958和WO 2009/110796中描述的技术，实现了在曲霉属真菌(Aspergillus)(另外，还有其他微生物)中从柠檬酸盐产生衣康酸。

但是，与衣康酸盐类似，柠檬酸盐也可用作生产苹果酸盐、琥珀酸盐、谷氨酸盐和甲基丙烯酸的起始点。