[发明专利]用于光片显微技术的设备

说明书

本发明涉及一种用于光片显微技术的设备。这种设备包括用于容纳位于介质(2)中的样本(3)的样本容器(1)，其中，样本容器(1)具有盖部并且相对于平面形参照面被定向。该设备还包括具有照明物镜(6)的照明光学系统，用于以光片照明样本(3)，其中，照明物镜(6)的光学轴线(7)与光片位于这样的平面中，该平面与参照面的法线围成不等于0的照明角度β。该设备还包括具有检测物镜(8)的检测光学系统，检测物镜(8)的光学轴线(9)与参照面的法线围成不等于0的检测角度δ。在这种设备中，在盖部上，即在容器底板(11)或者容器顶板(18)上，构建有至少一个对于照明和检测光透明的拱曲部用于容纳样本(3)，该拱曲部具有内边界面(12)和外边界面(13)。该拱曲部的形状、其在观察中的位置以及照明物镜(6)和检测物镜(8)的光学轴线(7,9)的位置被相互协调，方法是，照明物镜(6)和检测物镜(8)的光学轴线(7,9)与边界面(12,13)的法线至少在光学轴线(7,9)穿过边界面的区域中围成最小角度。

本发明涉及一种用于光片显微技术的设备。这种设备包括用于容纳位于介质中的样本的样本容器，其中，样本容器相对于平面形的、通常水平的参照面被定向。该设备还包括具有照明物镜的照明光学系统，用于以光片照明样本，其中，照明物镜的光学轴线与光片位于这样的平面中，该平面与参照面的法线围成不等于0的照明角度β。最后，该用于光片显微技术的设备还包括具有检测物镜的检测光学系统，检测物镜的光学轴线与参照面的法线围成不等于0的检测角度δ。照明物镜和检测物镜在此也可以构建为所谓的双物镜，如例如在EP 0 866 993 B1中所描述的那样。两个物镜于是综合在共同的结构单元中，于是，各个光学系统，即物镜及其所属的光路和位于其中的光学元件，共享一些元件。

这种设备尤其在检查生物样本时使用，在该检查中，以光片照明样本，光片的平面与检测的光轴线以不等于0的角度相交。通常在此，光片与通常为检测物镜的光轴线的检测方向围成直角。借助该也称作SPIM(Selective Plane Illumination Microscopy选择性平面照明显微镜)的技术可以在较短时间中也建立较厚样本的空间记录。基于光学剖切结合在垂直于剖面的方向上的相对运动，可以以图像方式、空间延展地示出样本。

SPIM技术优选用于荧光显微镜，在那里该技术也称作LSFM(Light SheetFluorescence Microscopy光片荧光显微镜)。相对于诸如共焦激光扫描显微镜或二光子显微镜的其它已知方法而言，LSFM技术具有多个优点：因为检测可以在宽视场中进行，所以可以采集更大的样本区域。虽然分辨率比共焦激光扫描显微镜小一些，但是用LSFM技术还可以分析更厚的样本，因为进入深度更大。此外，在该方法中，样本的光负荷是最小的，这尤其降低了使样本褪色的风险，因为样本仅通过与检测方向成不为0的角度的薄光片被照射。

在此，不仅能使用例如借助圆柱透镜产生的纯静态光片，还能使用准静态光片。该准静态光片可以通过用于光束迅速扫描样本的方式来产生。通过使光束经历相对于待观察样本的极为快速的相对运动以及在此时间上相继地多次连续进行，形成了光片状的照明。在此，将其上的传感器最终成像样本的相机的积分时间(Integrationszeit)选择为使得扫描在积分之间内完成。替代具有2D阵列的相机，还可以使用结合检测光学系统中的重新扫描(Rescan)的阵列传感器。该检测还可以共焦地进行。

SPIM技术如今在文献中被多次描述，例如在DE 10257423A1和基于其的WO 2004/053558A1中或者在概览性文章“Selective Plane Illumination Microscopy Techniquesin Developmental Biology发育生物学中的选择性平面照明显微镜技术”，J.Huisken等著，发表于2009年，杂志Development，136卷，1963页中。

光片显微镜的主要应用之一在于成像平均尺寸的、大小为100μm至数毫米的有机体。通常，这些有机体嵌入在琼脂糖凝胶中，其又位于玻璃毛细管中。玻璃毛细管被从上方或下方引入到装有水的样本室中，并且将样本从毛细管中挤出一段。用光片照明琼脂糖中的样本，并且用垂直于光片和由此也垂直于光片光学系统的检测物镜将荧光在照相上成像。