[发明专利]离散的细胞培养微环境的阵列、制备该阵列的方法及其用途

说明书

本发明涉及具有影响细胞的表型和命运，即增殖/自我更新、集落形成、分化和/或迁移的不同性质，即不同的机械和/或生化性质(即细胞粘附、信号转导、降解性等)的细胞培养微环境的离散体积的阵列，制备该阵列的方法，制备该阵列的组件试剂盒和测试水凝胶制剂对细胞生长行为，特别是难以培养的细胞类型，例如干细胞的影响的组合方法。

背景技术

多年来已知的是，将二维细胞培养系统以及天然来源的三维细胞培养系统作为模型以阐明复杂的细胞行为，尤其是在癌症或干细胞研究的领域。

二维细胞培养系统具有的缺点是不能实现与在体内发现的那些很类似的基因表达模式和细胞表型。进一步地，不能期望它们忠实地复制体内细胞培养微环境的某些关键的生理学特性，尤其是空间约束、蛋白水解重构、刚性介导(stiffness-mediated)的力学转导和配体呈递的适当模式。

天然来源的3D细胞培养系统的组成未明确确定并且显示出批次间差异，使得以系统的方法改变它们的性质并且独立地控制它们的关键基质参数是不可能的。

因此，本发明的目的是克服现有技术的缺点，尤其是提供能够快速识别控制希望的细胞行为的细胞培养和细胞培养微环境的工具和方法。

发明概述

本发明的第一个方面涉及细胞培养微环境的离散体积的阵列，所述微环境(优选地各自)具有影响包封的细胞的行为的不同性质。

如本文所理解的，术语“包封在细胞培养微环境中”或类似的表达指细胞(或多种细胞)以如下的方式被包埋在基质中：它们被所述基质完全地包围，从而模拟天然存在的细胞生长条件。

如本文所理解的，术语“微环境”或“微环境的体积”分别指适于高通量测试设备，尤其是多孔板的体积。在多孔板中被分析的典型体积的范围为约100nl至约500μ1，优选为约200nl至约20μ1。

术语“离散的体积”涉及在阵列内空间上分离的点或区域。分离的点或区域可以相互接触或通过例如塑料屏障相互分离。在这些离散的体积的每一个之中或之上，希望的细胞类型的细胞可以以这样的方法放置，以使它们相互分离。它们从试验开始就不相互接触，并且随着时间保持，从而独立于邻近的体积生长并且仅仅受它们的细胞培养微环境的影响。

具体地，可以使用三维水凝胶的阵列，所述三维水凝胶具有离散的体积并且具有影响细胞的增殖/自我更新、集落形成、分化和/或迁移的不同性质。使用的水凝胶通过交联水凝胶前体分子获得，优选为亲水聚合物，例如基于聚(乙二醇)(PEG)的聚合物，最优选为通过与细胞相容的交联反应交联的多臂的基于PEG的聚合物。

如本文所理解的，“通过细胞相容的反应(或多种反应)可交联的”(或类似术语)包括基于以下两者的反应：(i)共价键形成，选自a)酶催化的反应，优选其依赖于活化的谷氨酰胺转移酶因子XIIIa；以及b)非酶催化的反应和/或非催化的反应，优选为迈克尔加成反应；和/或ii)非共价键形成(例如基于疏水相互作用、H键、范德华力或静电相互作用；特别是通过温度变化或缓冲液的离子强度的变化诱导的)。

在优选的实施方案中，选择基于PEG的前体分子，以使通过详述于2007年Ehrbar等人的交联机制在生理条件下使用凝血酶活化因子XIIIa，或通过详述于2003年Lutolf等人的交联机制通过温和化学反应是可交联的。

在所述阵列的离散的体积中，水凝胶前体分子的交联在将被研究的细胞类型的存在下以这样的方式实现，将细胞通过水凝胶基质包封，即细胞处在不同的细胞培养微环境中。

在3D中，来自细胞培养微环境的各种力学和生化因子在增殖/自我更新、分化、迁移和/或集落形成方面影响细胞的行为。在根据本发明的阵列中，这些因子可以在体积与体积之间不同，并且因此能够在许多，优选为数百或数千的独特细胞培养微环境中同时研究单个因子或因子的组合对细胞类型的影响。这样，可以系统地剖析在细胞培养微环境中个体因子对细胞命运的作用，尤其是可以快速地确定控制难以培养的细胞类型，例如干细胞的行为的水凝胶细胞培养微环境。

根据本发明的三维水凝胶基质的力学性质可以通过改变细胞培养微环境的聚合物含量以及聚合物凝胶前体的分子量和/或官能度(可以用于交联的位点的数目)而变化。因此，例如由杨氏模量(E)表示的基质的刚度可以在300到5400pa之间变化。