[发明专利]甲羟戊酸二磷酸脱羧酶变体

说明书

本发明涉及在将3-膦酰氧基异戊酸转化成异丁烯中具有改进的活性的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶变体。另外，本发明涉及酶，所述酶的特征在于它们能够将3-膦酰氧基异戊酸以多于0.1s^-1的k_cat转化成异丁烯。

许多的化学化合物目前源自石油化学品。烯类(如乙烯、丙烯、不同的丁烯或其他戊烯，例如)在例如用于产生聚丙烯或聚乙烯的塑料工业，和在化学工业其他领域和燃料领域中使用。在过去数年，塑料(“生物塑料”)和生物燃料的生物生产已经变成繁荣发展的领域，归因于与油价相关的经济顾虑和全球性(碳中和产品)和本地(废物管理)的环境考虑。因此，需要用于产生烯类如异丁烯的有效率的酶。

WO2010/001078描述了通过用具有脱羧酶活性的酶，例如甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶，酶促转化3-羟基烷酸而产生烯类(如异丁烯)的方法。这种方法是有利的，因为它有助于避免使用石油产品，有助于降低产生塑料和燃料的成本，并且通过允许以固体形式储藏碳能够产生可观的全球环境影响。可以显示，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶能够利用除其天然底物甲羟戊酸二磷酸，尤其3-羟基烷酸之外的底物，并将它们转化成最终的烯。甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶(酶命名法EC4.1.1.33)是参与胆固醇生物合成的酶。这种酶已经从包括动物、真菌、酵母和一些细菌的多种生物分离。它也可以由一些植物表达(Lalitha等人,Phytochemistry24(11),(1985),2569-2571)。已经克隆和测序了编码这种酶的许多基因。这些酶是通常由300至400个氨基酸组成并且使用ATP作为共底物，所述ATP在反应期间转化成ADP和无机磷酸。在第一步骤中，磷酸基团从ATP分子转移至甲羟戊酸二磷酸的叔醇，释放ADP。在3-羟基上磷酸化的反应中间体在第二步骤中经历磷酸基团的消除及脱羧，在生理情况下释放异戊烯基二磷酸。

MDP脱羧酶已经从多种不同真核和原核生物分离，并且已经详细分析及表征。另外，已经产生多种突变体以鉴定可能在酶的酶促活性中发挥重要作用的氨基酸残基。例如，Alvear等人(Biochemistry21(1982),4646-4650)描述禽肝MDP脱羧酶的纯化和表征，并且Dhe-Paganon等人(Biochemistry33(1994),13355-13362)描述了受MDP脱羧酶催化的反应的机理。Berges等人(J.Bacteriol.179(1997),4664-4670)报道了导致热敏感性的酿酒酵母(S.cerevisiae)MDP脱羧酶的突变。Krepkiy和Miziorko(ProteinSci.13(2004),1875-1881)鉴定酵母的MDP脱羧酶中的活性位点残基并且分析了导致活性降低的突变。类似地，Krepkiy和Miziorko(Biochemistry44(2005),2671-2677)就其相关性研究了位于MDP脱羧酶的所建议的结构域间活性部位裂隙中的保守丝氨酸残基并且可以证实这些丝氨酸残基中任一个的突变均导致活性降低或丧失。另外，Qiu等人(Bioorganic&medicinalChemistryLetters17(2007),6164-6168)分析了(大鼠)MDP脱羧酶并报道了导致活性降低或丧失的多种突变体。Voynova等人(Arch.Biochem.Biophys.480(2008),58-67)表征了人MDP脱羧酶并鉴定出导致酶活性降低或损失的若干氨基酸残基。