[发明专利]体外诊断方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于在体液中测定巯基嘌呤S-甲基转移酶的酶活性的体外方法。具体地，本发明涉及这样的一种方法，其中尿硫酮(urothione)含量和/或朱卡硫酮(jukathione)含量在血浆、血清和/或尿中体外测定，以便测定巯基嘌呤S-甲基转移酶的酶活性。进一步地，本发明涉及一种尿硫酮和/或朱卡硫酮作为生物标记物的体外诊断方法。

背景技术

巯基嘌呤S-甲基转移酶(下文主要称为TPMT)是在各种形式的白血病和慢性炎症性疾病的治疗的药物代谢中的关键酶。TPMT将细胞抑制药物(例如6-巯嘌呤)转化为临床上不活跃的甲基化形式(例如6-甲基巯嘌呤)，再经肾排除。尽管TPMT具有下文所述的药理学重要性，但是它的生理底物和TPMT在人类代谢中的作用是未知的。

巯基嘌呤，例如6-硫鸟嘌呤(6-TG)、6-巯嘌呤(6-MP)或咪唑硫嘌呤(AZA)，是广泛用于白血病(例如急性淋巴细胞白血病)、自体免疫疾病(例如克罗恩氏病、类风湿性关节炎)的治疗以及用于器官移植的接受者的嘌呤拮抗物。它们是天然生成的核酸碱基鸟嘌呤的类似物。巯基嘌呤的其他适应症是，例如，非霍奇金淋巴瘤，溃疡性结肠炎，真性红细胞增多，银屑病关节炎，各种自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮，遗传病的疾病，其他形式的血管炎，自身免疫性肝炎，特应性皮炎，重症肌无力，视神经脊髓炎(德维克氏病)，限制性肺病。

TPMT是甲基化巯基嘌呤化合物的酶。更具体地，TPMT催化巯基嘌呤剂的S-甲基化。甲基供体是S-腺苷基-L-蛋氨酸，其又通过反应被转化为S-腺苷基-L-高半胱氨酸。也就是说，TPMT利用S-腺苷基-L-蛋氨酸作为S-甲基供体来使巯基嘌呤剂代谢，同时形成作为副产物的S-腺苷基-L-高半胱氨酸。

影响TPMT酶活性的遗传多态性与巯基嘌呤药物在患者治疗中的响应和副作用相关。

巯基嘌呤S-甲基转移酶(TPMT；EC2.1.1.67)是催化巯基嘌呤药物如硫唑嘌呤(AZA)和6-巯基嘌呤(6-MP)的S甲基化的胞内酶。酶活性本身显示在红细胞(RBC)中差异极大，大约是200个高加索人中有1个完全缺乏，而11％显示中间状态，89％显示正常TPMT活性(schaeffeleretal.2004)。此外，1-2％的高加索人偏离这个多峰分布，表现出非常高的水平(Schaeffeleretal.2004)。由于巯基嘌呤为主的免疫抑制剂只提供相对有限的治疗范围，因此TPMT多态性显著地影响两个甲基化代谢物6-甲基巯嘌呤(甲基嘌呤核糖核苷酸)和硫鸟嘌呤核苷酸(所谓的6-TGN)的比值，从而确定巯基嘌呤在患炎症性肠病、急性淋巴细胞白血病和其他疾病(summarizedinTemletal.2007)的病人中治疗的有效性和毒性。例如硫唑嘌呤或6-MP标准剂量治疗期间，具有减少或缺乏TPMT活性的个体的骨髓抑制的风险增加，因为在这些情况中存在过高的6-TGN水平。因此，这些患者需要在巯基嘌呤治疗中单独地调整剂量(KaskasetalGut2002)

相比之下，具有非常高水平的TPMT活性的个体处于发展治疗抗性(由于过低的6-TGN水平)的危险之中，因为巯基嘌呤代谢物的密集的甲基化发生在这些情况中，并且为此，活性的6-TGN代谢物以较小的量形成。此外，肝脏损伤可由高6-甲基巯嘌呤核苷酸水平(Dubinskyetal.2000,Nygaardetal.CPT2008)引起。急性淋巴细胞性白血病和高水平TPMT活性的儿科患者在标准条件下复发的风险增加(Stanullaetal.2005)。

TPMT缺陷的分子机理很容易理解。TPMT构成为数不多的几个例子之一，其中药物遗传现象被译为对于最佳巯基嘌呤剂量的调整普遍公认的诊断性的常规实验。这些建议最近得到了更新(Rellingetal.2013)，尽管现在仍不知TPMT的内源性底物。

TPMT活性通常在红细胞(RBCs)中测定。非常低的、中间的和正常的活性的截断值被限定，所述截断值强烈依赖于所使用的测量方法例如辐射化学测定(Weinshilboumetal.1978)或基于HPLC的方法(Kroplinetal.1998)。